棗瘋病植原體TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法的建立

韓 劍, 羅 明*, 徐金虹, 王同仁, 張祥林

(1. 新疆農業大學農學院, 烏魯木齊 830052； 2. 新疆阿瓦提縣農技推廣中心,阿瓦提 843200；3. 新疆出入境檢驗檢疫局,烏魯木齊 830063)

棗瘋病植原體TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法的建立

韓 劍1, 羅 明1*, 徐金虹2, 王同仁2, 張祥林3

(1. 新疆農業大學農學院, 烏魯木齊 830052； 2. 新疆阿瓦提縣農技推廣中心,阿瓦提 843200；3. 新疆出入境檢驗檢疫局,烏魯木齊 830063)

根據棗瘋病植原體16S rDNA基因保守區域設計、合成特異性引物和TaqMan探針,以構建的重組質粒作為陽性標準品,建立并優化了對棗瘋病植原體的TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。對優化后的方法進行靈敏度、特異性及穩定性評價,制作了標準曲線。結果顯示,制作的標準曲線有極好的線性關系,相關系數(r2)達到0.998,建立的實時熒光定量PCR檢測方法能夠特異性地檢測棗瘋病植原體,能檢測到60拷貝的質粒DNA。本研究建立的實時熒光定量PCR檢測方法靈敏度、特異性、重復性好,不僅能夠實現對棗瘋病植原體的快速檢測,而且為實現從病原定量水平上對棗瘋病病情分級奠定了基礎。

棗瘋病植原體； TaqMan探針； 實時熒光定量PCR； 檢測

棗瘋病(jujube witches’ broom, JWB)是由植原體引起的、在棗樹生產中具毀滅性危害的病害[1]。棗瘋病植原體主要通過人工嫁接、根蘗和葉蟬類昆蟲介體等方式傳播,病原寄生于植株維管束韌皮部內,樹體一旦感病,終身帶菌并隨著苗木擴散和遠距離傳播,具有分布廣、傳播速度快、致死率高等特點。棗瘋病在國內幾乎遍布于各大棗樹栽培區,局部地區暴發成災,棗園瀕臨毀滅。每年因棗瘋病而死的樹高達千萬株,直接經濟損失高達數億元,嚴重阻礙了紅棗產業的發展[2-3]。棗瘋病防治是世界性的難題,多數棗樹品種對其敏感。盡管藥劑處理、控制傳病介體等方法具有一定減輕和延緩發病的作用,但無法根除[4]。要從根本上解決棗瘋病的防治問題必須采取有效的預防措施,嚴格對苗木進行檢疫檢驗和脫毒處理,采用健康苗木和接穗建立無病苗木繁育體系,從源頭上杜絕病原,而建立和應用先進的病原檢測技術是棗樹無病苗木生產的核心所在。

隨著分子生物學技術的快速發展,PCR技術已廣泛應用于植原體的檢測鑒定[5-7]。目前,根據植原體16S rDNA、核糖體蛋白質(rp)、延伸因子(tuf)等基因序列設計引物,通過常規PCR或巢式PCR擴增是檢測植原體較常用的手段。但在實際應用過程中,PCR產物需經電泳、染色劑溴化乙錠染色后才能判斷擴增結果,存在著操作步驟繁瑣,易于造成交叉污染,降低檢測靈敏度的問題。近年發展起來的TaqMan探針實時熒光PCR技術是在常規PCR反應體系中添加了一條標記了2個熒光基團的探針,即TaqMan探針。與常規PCR定性檢測相比,該法具有更加靈敏、簡便、高效、穩定和定量化等優點[8]。本研究應用TaqMan探針實時熒光定量PCR技術建立了針對棗瘋病植原體高特異性檢測方法,并應用于田間檢測,驗證了該方法的靈敏度及特異性,實現了從病原定量水平上對棗瘋病病情的分級。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2009年8月至2012年7月在新疆阿克蘇、喀什等地區棗樹栽培區調查,采集到表現為叢枝、小葉、黃化等癥狀的棗瘋病疑似植株,樣品保存于4 ℃冰箱和液氮中。同時采集健康植株枝葉作為對照。泡桐叢枝病植原體、葡萄金黃化植原體及翠菊黃化植原體由新疆出入境檢驗檢疫局提供。

1.2 試劑及儀器

PGM-T載體、質粒小提試劑盒及RealMasterMix(Probe)購自天根生化科技有限公司。主要儀器：實時熒光PCR儀(Roche Lightcycle 2.0),ND-1 000核酸/蛋白檢測儀(Nano Drop公司)。

1.3 棗樹葉片總DNA提取

采用植物基因組提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit,TIANGEN)提取棗樹葉片總DNA。

1.4 重組質粒的構建和定量

以提取的總DNA為模板,利用引物[9]R16mF2: 5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′,和R16mR1: 5′-CTTAACCCCAATCATCGA-3′擴增棗瘋病植原體16S rDNA基因片段,擴增產物經回收、純化,克隆于PGM-T載體上,提純含棗瘋病植原體16S rDNA的質粒作為質粒標準品,用核酸蛋白紫外分析儀測定A260,計算其質量濃度和拷貝數,-20 ℃保存備用。

1.5 實時熒光定量PCR檢測方法的建立及優化

1.5.1 引物及探針設計

在GenBank中搜集已公布的植原體及有代表性細菌的16S rDNA核酸序列,利用Omiga軟件對上述序列進行比較及一致性分析,找出棗瘋病植原體與其他植原體的基因差異位點。用軟件Beacon Designer 7.0篩選出一對引物JWB primer-F/JWB primer-R,引物對經在線序列同源性分析,確定為棗瘋病植原體的特異性引物對,并在該引物對的擴增區域設定一條熒光TaqMan探針JWB-probe(表1)。引物和探針由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成,探針5′端標記報告熒光染料為6-carboxyfluorescein(FAM),3′端標記淬滅熒光染料為tetramethycarboxyrhodamine (TAMRA)。

表1實時熒光定量PCR的引物及探針序列

Table1SequenceofprimersandTaqManprobeforreal-timefluorescentquantitativePCR

名稱Name序列(5′?3′)Sequences擴增目的片段長度/bpAmplifiedfragmentlengthJWBprimer?FTGGTGAGGTAAAGGCTTAJWBprimer?RCTCCCGTAGGAGTTTGG98JWB?probeFAM?TGGTGAGGT?AAAGGCTTA?TAMRA

1.5.2 實時熒光定量PCR反應條件

反應體系(20 μL)：2.5×realMasterMix 8.0 μL,上游引物JWB primer-F (10 μmol/L) 0.5 μL,下游引物JWB primer-R (10 μmol/L) 0.5 μL,探針JWB-probe(10 μmol/L) 0.5 μL,20×probe enhancer solution 1.0 μL,模板1.0 μL,ddH2O 8.5 μL。反應程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min,40個循環;68 ℃收集熒光信號。

1.5.3 實時熒光定量PCR反應體系引物對及探針濃度的優化

對反應體系中的引物、探針濃度分別進行優化。將引物對濃度從0.1～1.0 μmol/L以0.1 μmol/L依次遞增,探針濃度從0.05～0.5 μmol/L以0.05 μmol/L依次遞增,其他條件均不變,通過ΔRn與循環數關系的曲線圖確定ΔRn值最大且Ct值最小的最佳引物濃度和探針濃度。

1.6 實時熒光定量PCR的靈敏度試驗及標準曲線的建立

將構建的棗瘋病植原體質粒進行10倍系列稀釋,并以此作為標準陽性模板,利用優化得到的最佳反應體系進行實時熒光定量PCR檢測。檢測結束后通過ΔRn與循環數關系的曲線圖確定TaqMan探針的檢測靈敏度,并根據得到的動力學曲線,得出相應的標準曲線方程。

1.7 實時熒光定量PCR的特異性驗證

分別提取棗瘋病植原體(16SrⅤ組),葡萄金黃化植原體(16SrⅤ組),泡桐叢枝植原體(16SrⅠ組),翠菊黃化植原體(16SrⅠ組)以及田間采集及實驗室保存的健康棗樹基因組DNA作為模板,進行棗瘋病植原體實時熒光定量PCR檢測的特異性試驗。

1.8 實時熒光定量PCR重復性試驗

對3種不同濃度的標準質粒(反應初始體系中含6.09×104、6.09×105和6.09×106拷貝/μL)利用得到的優化反應體系重復檢測3次。計算循環閾值(Ct)的平均值、標準差(SD)和變異系數(CV)來評價該方法的穩定性。變異系數(CV)=測定結果的標準差與其平均值的百分比。

1.9 田間樣品的適用性檢測

從新疆紅棗產區采集不同表觀癥狀、不同病級的枝條樣品,采用本研究建立的實時熒光定量PCR體系進行檢測,并利用建立的標準曲線對樣品中的植原體含量定量分析。

2 結果與分析

2.1 實時熒光PCR體系優化

對反應體系中的引物、探針濃度進行篩選優化,以獲得ΔRn值最大,Ct值最小的最佳擴增反應體系。

如圖1所示,引物對濃度配比在0.1～1.0 μmol/L范圍內,擴增曲線的ΔRn值先隨引物濃度的升高而升高,當濃度為0.5 μmol/L時,可獲得最大ΔRn值和較小的Ct值,之后ΔRn值隨引物濃度升高而降低。最終確定最佳引物對濃度為0.5 μmol/L。

探針濃度試驗結果表明(圖2),隨著探針濃度遞增,ΔRn依次增加,在0.4 μmol/L時,ΔRn值達到最大,但是相對應的曲線不平滑。之后ΔRn值隨著探針濃度的遞增而降低,說明探針過量,無足夠的PCR產物與探針結合。經過多次重復試驗,并從經濟節約的角度考慮,選擇0.25 μmol/L為最佳反應用量。

圖1 引物對濃度優化

圖2 探針濃度優化

2.2 靈敏度試驗

以所構建的棗瘋病植原體質粒標準品(濃度測定為280 ng/μL,對應為6.09×1010拷貝/μL)的10倍系列稀釋液作為標準陽性模板進行實時熒光定量PCR和常規PCR檢測。結果顯示(圖3)：實時熒光PCR反應可檢測模板濃度的下限為6.09×10 拷貝/μL(2.8 fg/μL)。

以標準陽性模板不同濃度的對數值為橫坐標,循環數為縱坐標作圖,得到標準曲線(圖3)。結果顯示,標準曲線的斜率為-3.354,擴增效率>90%,Ct值和質粒拷貝數的對數值之間具有良好的相關性(r2=0.998)。因此根據未知樣品的Ct值和回歸方程,即可對起始模板的拷貝數精確定量。

圖3 實時熒光PCR靈敏度

2.3 特異性驗證

以提取的相同濃度的棗瘋病植原體、葡萄金黃化植原體、泡桐叢枝植原體,翠菊黃化植原體總DNA為模板,用本研究設計合成的引物(JWB primer-F/JWB primer-R)和探針(JWB-probe)進行實時熒光PCR檢測驗證其特異性。結果顯示(圖4),除棗瘋病植原體DNA有熒光信號產生外,其余植原體均未收集到熒光信號。說明本檢測體系所用的引物及探針直接針對棗瘋病植原體檢測,而與棗瘋病植原體同屬榆樹黃化組(16SrⅤ組)的葡萄金黃化植原體,屬于植原體翠菊黃化組(16SrⅠ組)的泡桐叢枝植原體、翠菊黃化植原體以及健康棗樹均未檢測到熒光信號增加,可見引物及探針具有很強的特異性。

圖4 實時熒光PCR特異性

2.4 實時熒光PCR的重復性

重復性試驗結果顯示(表2),各重復試驗的Ct值誤差均不到1個循環,且Ct值變異系數均小于5%。證明本研究建立的實時熒光PCR體系重復性好,從而保證了不同樣品間檢測結果的可靠性和穩定性。

表2實時熒光PCR的重復性檢測

Table2Repetitiondetectionbythereal-timePCR

質粒/拷貝·μL-1Plasmid樣品Ct值TheCtvaluesofthesamplesCt1Ct2Ct3Ct平均值TheaveragevalueofCtSDCV/%6．09×10615．2315．2515．9315．470．402．56．09×10518．6719．0518．7218．810．211．16．09×10422．0422．5322．1222．230．261．2

2.5 田間樣品的適用性檢測

對田間采集病株樣品分別采用常規PCR和實時熒光定量PCR檢測。常規PCR對發病癥狀為2級、3級病株的檢測結果為陽性反應,無癥狀(0級)病株檢測結果為陰性。而實時熒光定量PCR檢測,病情為2級、3級以及無癥狀(0級)病株檢測結果均為陽性反應,其Ct值依次為20.77、14.39、24.56。通過建立的棗瘋病植原體熒光定量PCR標準曲線方程計算出病情級別為2級、3級的棗樹枝葉中植原體16S rDNA片段拷貝數分別為1.66×105個/g 鮮重和 1.32×107個/g 鮮重,而無明顯癥狀(0級)的枝葉中植原體16S rDNA片段拷貝數達到1.23×104個/g 鮮重。結果證明,實時熒光定量PCR檢測提高了檢測靈敏度,能檢測出侵染初期處于隱癥狀態的樣品中棗瘋病植原體的存在。

3 討論

植原體的分離培養至今尚未獲得成功。由于植原體在植株體內含量低,又不像病毒易于提純,檢測難度大。長期以來,植原體的檢測主要依靠生物學測定(表觀癥狀、嫁接傳病)、電鏡觀察、組織化學、血清學等方法[10-12],存在靈敏度低、特異性差、周期長和操作繁瑣等不足,已不能滿足現代生產的需要。最近十幾年,隨著分子生物學技術的快速發展,植原體檢測技術才得到了重大突破。普通PCR、巢氏PCR和免疫捕獲PCR等技術應用使植原體檢測靈敏度有了顯著提高。但這些方法過程繁雜,操作步驟多,效率低,而且需要PCR后處理,如瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色,不僅費時費力又易造成污染和假陽性,影響對結果的正確判斷,降低了檢測的靈敏度。本研究建立的棗瘋病植原體TaqMan探針實時熒光PCR檢測靈敏度達到60 拷貝/μL。整個過程采用完全閉管檢測,根據擴增曲線直接判斷結果,省去了對PCR產物電泳、染色等繁瑣的步驟,避免了可能造成的PCR產物交叉污染。且能在1 h內完成過程,大大提高了檢測效率。

廖曉蘭等[13]首次將實時熒光PCR技術用于植原體的檢測,設計并合成了植原體廣譜熒光探針和針對椰子致死黃化組(16SrⅣ組)、蘋果叢生組(16SrⅩ 組)和榆樹黃化組(16SrⅤ組)植原體的組特異性熒光探針,成功地檢測了9種植原體。侯立華等[14]設計合成了榆樹黃化組(16SrⅤ組)探針對棗瘋病植原體拷貝數進行了定量檢測,靈敏度達到了85 拷貝/μL。已報道這些方法是針對植原體16SrⅤ組設計的引物和探針,用于檢測植原體16SrⅤ組的成員,實現植原體組間的特異性檢測。16SrⅤ組劃分為3個亞組[15],包括榆樹黃化(16SrⅤ-A)棗瘋病(16SrⅤ-B)、葡萄金黃化(16SrⅤ-C)等多種重要的植原體。研究發現,16SrⅤ組內的植原體菌株間序列差異很小(<1.2%),要對不同亞組植原體進行區分和鑒定較為困難[16]。本研究在對植原體大量基因信息進行分析比較的基礎上,設計了針對棗瘋病植原體特異性的探針及引物。特異性檢測結果表明,對本研究中從新疆獲得的多個棗瘋病菌株均可產生明顯的增強熒光信號,而隸屬于同組但不同亞組的葡萄金黃化植原體和不同組(16SrⅠ組)的泡桐叢枝植原體、翠菊黃化植原體均未檢測到熒光信號增加,可見設計的探針及引物具有較好的特異性,提高了棗瘋病植原體檢測的針對性和檢測效率。但由于植原體標樣來源的限制,特異性檢測供試的植原體種類較少,且只涉及植原體的2個組。因此,需進一步廣泛收集菌株,擴大檢測范圍以進一步驗證其特異性。

棗瘋病為維管束傳導的系統感染性病害。棗樹感染植原體后,會引起樹體一系列的生理代謝紊亂,病情由輕到重演變,其可控程度也由易到難[17-18]。因此,掌握棗瘋病病情的發生、發展規律,根據病級,因樹、因園、因地制宜采取分類治理措施,對于病害的綜合防治具有重要意義。劉孟軍等[19]依據癥狀特點,建立了從組織、病枝、病株、病園和病區等5個水平對棗瘋病病情分級的標準。但其病情分級未反映不同病級植株體內病原累積狀況。本研究應用建立的TaqMan探針實時熒光PCR方法,對不同癥狀病級的病樣中植原體進行了精確定量,證明了該檢測方法可從微觀水平反映病原從初侵染到逐步積累,是對依據癥狀劃分病級的補充,能更加客觀、科學地反映病害發展進程。同時,通過檢測發現棗園中無癥帶菌處于隱癥狀態病株普遍存在,經過1～2年期的潛伏逐漸表現癥狀。

近幾年來,新疆紅棗生產規模快速擴張和迅猛發展,僅南疆地區的棗樹栽培面積就已近30萬 hm2,成為我國最大的紅棗生產基地。南疆地區絕大多數為新建棗園,通過直接調入苗木和以酸棗作砧木,引入接穗進行嫁接,并結合扦插、分株等無性繁殖方式解決苗木的供應問題,極易引起棗瘋病的感染及傳播。2009年,筆者首次發現并報道了棗瘋病已在新疆南疆部分地區發生[20-21],目前尚屬個別、零星、團簇狀分布,但個別棗園局部發生嚴重,對蓬勃發展的紅棗產業帶來嚴重的隱患。因此,建立快速、準確的棗瘋病植原體檢測方法對于病害的早期診斷、口岸檢疫、田間流行監測預報和指導病害的綜合防治提供了良好的技術支撐。

[1]田國忠, 張志善, 李志清, 等. 我國不同地區棗瘋病發生動態和主導因子分析[J]. 林業科學, 2002,38(2):83-91.

[2]范俊秀. 棗瘋病和棗縮果病研究進展[J]. 山西林業,2009,37(6):37-39.

[3]Sun Xianchao, Mou Haiqing, Li Tingting, et al. Mixed infection of two groups (16SrI &V) phytoplasmas in one single jujube tree in China [J]. Journal of Phytopathology, 2013,161(9):661-665.

[4]劉孟軍, 趙錦, 周俊義. 棗瘋病[M]. 北京:中國農業出版社, 2010:137-154.

[5]介大委, 翟曉巧, 聶琳. 植原體檢測和鑒定技術[J]. 河南林業科技, 2009,29(1):39-44.

[6]Lee I M, Hammond R W, Davis R E, et al. Universal amplification and analysis of mycoplasma like organisms[J]. Phytopathology, 1993,83:834-842.

[7]徐啟聰, 田國忠, 王振亮, 等. 中國各地不同棗樹品種上棗瘋病植原體的PCR檢測及分子變異分析[J]. 微生物學報, 2009,49(11):1510-1519.

[8]Heid C A, Stevens J, Livak K J, et al. Real-time quantitative PCR[J]. Genome Research, 1996,6:986-994.

[9]Lee I M, Davis R E, Gundersen-Rindal D E. Phytoplasma:phytopathogenic mollicutes[J]. Annual Review of Microbiology, 2000,54:221-255.

[10]金開璇, 汪躍, 張銳, 等. 山楂叢枝病類菌原體(MLO)的電鏡觀察[J]. 林業科學研究, 1992,5(3):365-366.

[11]金開璇, 田國忠, 汪躍. 組織化學技術快速檢測泡桐叢枝病研究[J]. 植物病理學報, 1989,19(3):185-188.

[12]Khadhair A H, McClay A, Hwang S F, et a1. Aster yellows phytoplasma identified in scentless chamomile by microscopica examinations and molecular characterization [J]. Journal of Phytopathology, 1999,147(3):149-154.

[13]廖曉蘭, 朱水芳, 陳紅運, 等. 植原體TaqMan探針實時熒光PCR檢測鑒定方法的建立[J]. 植物病理學報, 2002,32(4):361-367.

[14]侯立華, 黃新, 朱水芳. 棗瘋病植原體實時熒光定量PCR檢測方法的研究[J]. 生物技術通訊, 2010,21(1):70-72.

[15]廖曉蘭, 朱水芳, 羅寬. 植原體的分類及分子生物學研究進展[J]. 植物檢疫, 2002,16(3):167-172.

[16]Davis R E, Dally E L. Revised subgroup classification of group 16SrV phytoplasmas and placement of Flavescence dorée-associated phytoplasmas in two distinct subgroups [J]. Plant Disease, 2001,85:790-797.

[17]Lee Sanghun, Kim Chuleung, Cha Byeongjin. Migration and distribution of graft-inoculated jujube witches’-broom phytoplasma within aCantharanthusroseusplant[J]. Plant Pathology Journal, 2012,28(2):191-196.

[18]Liu X G, Liu M J, Ning Q, et a1. Reverse-cleft in vitro micrografting ofZiziphusjujubaMill. infected with jujube witches’ broom (JWB) [J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2012,108(2):339-344.

[19]劉孟軍, 趙錦, 周俊義. 棗瘋病病情分級體系研究[J]. 河北農業大學學報, 2006,29(1):31-33.

[20]韓劍, 徐金虹, 王同仁, 等. 棗瘋病植原體新疆分離物16SrDNA基因克隆與序列分析[J]. 西北農業學報, 2012,21(4):176-180.

[21]韓劍, 徐金虹, 王同仁, 等. 新疆棗瘋病植原體tuf基因的克隆與序列分析[J]. 新疆農業科學, 2013,50(3):476-483.

Establishmentofreal-timefluorescentquantitativePCRmethodwithTaqManprobefordetectionofjujubewitches’broomphytoplasma

Han Jian1, Luo Ming1, Xu Jinhong2, Wang Tongren2, Zhang Xianglin3

(1.AgronomyCollege,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China;2.AwatAgriculturalTechnologyExtensionCenter,Awat843200,China;3.XinjiangEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Urumqi830063,China)

A set of primers and TaqMan probe specific for Jujube witches’ broom phytoplasma were designed according to the conserved region of 16S rDNA gene, and the recombinant plasmid was constructed as a standard control. A TaqMan real-time fluorescent PCR assay for quantitative detection of the pathogen was established and optimized. The evaluation assay indicated that a good linear correlation was demonstrated in the standard curve for the real-time fluorescent PCR assay, with the correlation coefficient (r2) of 0.998. The method was specific to jujube witches’ broom phytoplasma, and it can detect 60 copies/μL plasmid DNA. It not only provides a sensitive, specific and reproducible method for detection of jujube witches’ broom phytoplasma, but also lays the foundation for the grading system of the pathogen at quantitative level.

jujube witches’ broom phytoplasma; TaqMan probe; real-time fluorescent quantitative PCR; detection

2013-11-14

：2014-04-08

新疆維吾爾自治區高?？蒲杏媱濏椖?XJEDU2010S15)；新疆維吾爾自治區自然科學基金(2010211A17)；質檢公益性行業科研專項(201310091)

S 41; Q939.34

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.020

* 通信作者 E-mail:luomingxjau@sina.com