Transwell接觸共培養促進單散iPSCs生長及分化*

劉 慶, 郭永龍， 郭曉令， 連瑞玲， 陳建蘇, , 3△

(暨南大學 1附屬第一醫院眼科， 2再生醫學教育部重點實驗室， 3醫學院眼科研究所，廣東 廣州 510632)

人誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)擁有向各種人體細胞分化的潛能，且避免胚胎干細胞帶來的倫理問題和免疫排斥反應，因此成為組織工程研究理想的細胞來源[1]。但目前iPSCs在克隆團較小或懸浮培養時活性降低，阻礙了分化研究的開展[2]。在臨床工作中，因角膜內皮再生能力弱，角膜內皮損傷后修復成為治療角膜內皮疾病的一大難題[3]。已有文獻報道體細胞與干細胞共培養可以誘導干細胞向該種體細胞表型分化，接觸共培養可以顯著促進干細胞增殖及分化[4-5]。本實驗通過建立單散iPSCs與牛角膜內皮細胞(corneal endothelial cells, CECs)的Transwell接觸共培養模式，探討Transwell接觸共培養對單散iPSCs活性的影響及誘導iPSCs分化的表征變化，為進一步研究單散iPSCs培養及向CECs的分化提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

人臍帶源iPSCs(中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院贈)；mTeSR1培養基(STEMCELL); 低糖DMEM培養基, DMEM/F12培養基(HyClone)；Y27632、Matrigel、Accutase和堿性磷酸酶(alkaline phosphatease,ALP)染色試劑盒(Sigma-Aldrich); 0.25%-Trypsin-EDTA和胎牛血清(Gibco)；兔抗人Oct4和Nanog抗體(Cell Signaling)；兔抗人水通道蛋白1(aquaporin 1，AQP1)抗體、鼠抗人CD34抗體和羊抗鼠IgG抗體(Santa Cruz)；鼠抗人CD133 抗體(Miltenyi Biotec)；兔抗人CD31 抗體(博奧森)；鼠抗兔IgG抗體(Chemicon)；RNA提取試劑盒(Biomiga)；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒(Toyobo)；死活細胞染色試劑盒(Biotium)； 過濾器(Biologix)；熒光顯微鏡(Leica);倒置顯微鏡(Olympus); 6孔培養板(Corning); Transwell(1 μm)及配套的6孔板(BD); RS-1300 型超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)；二氧化碳培養箱(Alpha)。

2 方法

2.1牛CECs的分離與培養 取屠宰場死亡6 h內的牛眼球，按照文獻報道方法[3]分離牛CECs，1 200 r/min離心5 min，用含10%胎牛血清的低糖DMEM重懸細胞后按1×107/L 接種到6孔板上，放入37 ℃、5% CO2培養箱中孵育。48 h后換液，以后隔天換液。細胞融合至80%時傳代。本實驗中所用細胞均為第1代或第2代細胞。

2.2人iPSCs 的擴增培養 提前30 min用DMEM/F12培養基稀釋的體積分數1% Matrigel鋪板，37 ℃水浴箱解凍第40代人臍帶源iPSCs系，迅速轉移至15 mL離心管中，逐滴加入9 mL含體積分數0.1% Y27632的mTeSR1培養基，1 450 r/min、離心5 min，重懸細胞，注意不要將細胞吹散，轉移至6孔板，放入37 ℃、5% CO2培養箱中孵育，24 h后改用不加Y27632的mTeSR1培養基換液。每天換液，及時挑除分化細胞。5～7 d后傳代，提前30 min用Matrigel鋪板，Accutase 37 ℃消化3 min，用2個1 mL槍頭重疊后輕輕來回刮起克隆團，小心吹打5～10次至克隆團散開，注意不要吹散成單個細胞，按1∶3傳代。每次傳代后加入10 μmol/L Y-27632。

2.3單散iPSCs與牛CECs共培養 提前1 d將牛CECs細胞種到Transwell小室的底面培養8 h后，iPSCs克隆團消化后用槍頭刮起克隆團，小心吹打30～50次至克隆團幾乎散開成單個細胞，再用40 μm過濾器過濾去除未散開的iPSCs細胞。實驗組將單散細胞按1×107/L直接種到已經接種牛CECs的Transwell小室內。設定共培養組為實驗組，常規培養iPSCs組為對照組(一)，非共培養iPSCs單散細胞組為對照組(二)。3組細胞前3 d使用mTeSR1培養基，第4天開始用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基。以后每2 d更換1次培養基。每天倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄形態變化至第14天。

2.4iPSCs的鑒定 對共培養第3天的iPSCs單散細胞進行鑒定，對照組選用非共培養iPSCs單散細胞即對照組(二)。

2.4.1免疫熒光 吸棄培養基，PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS沖洗后加入含0.3% Triton X-100和3%牛血清蛋白混合液封閉30 min。分別加入1∶100稀釋的兔抗人Oct4和Nanog Ⅰ抗孵育，4 ℃冰箱過夜，PBS漂洗3遍，加入鼠抗兔IgG Ⅱ抗，室溫避光孵育1 h，PBS漂洗3遍，DAPI染色15 min后置于倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2.4.2實時熒光定量PCR(qPCR) RNA提取按照試劑盒操作步驟進行，所得RNA樣本檢測其A值，A260/A280在1.8～2.1范圍內表示RNA純度較高，未降解；用逆轉錄試劑盒反應體系將所得RNA轉錄成cDNA，反應溫度為37 ℃溫浴15 min，98 ℃加熱5 min；選用Premier 7.0進行引物設計，選用GAPDH為內參照，所得引物見表1。將cDNA加入PCR反應體系：SYBR Green Real-time Mix 12.5 μL,上游引物1 μL，下游引物1 μL,蒸餾水8 μL。反應溫度依次為95 ℃ 4 min，30個循環(95 ℃加熱10 s,58 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s)。PCR反應過程由熒光定量PCR儀每隔5 s記錄1次溫度在60 ℃～90 ℃間的熒光值。

表1 引物序列

2.4.3死活細胞染色 對細胞進行Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live & Dead Cells試劑盒染色，其中活細胞用鈣黃綠素AM(Calcein AM)染色，死細胞用乙啶二聚體-III (EthD-III)染色。按試劑盒操作說明配制染色液，PBS清洗細胞3遍，加入已配好的染色液，室溫避光孵育15 min后吸棄染液，PBS清洗2遍后倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照。運用ImageJ進行細胞計數。

2.5iPSCs誘導分化后的鑒定 對iPSCs共培養誘導分化14 d后的細胞進行鑒定。對照組選用進行常規培養的iPSCs細胞即對照組(一)。

2.5.1ALP染色 運用ALP染色試劑盒，使用前按照說明書預先配制染液，PBS漂洗細胞3遍，加入染液后常溫避光孵育15 min后PBS漂洗3次，在倒置顯微鏡下觀察，拍照。

2.5.2免疫熒光 固定封閉過程同前，分別加入1∶100稀釋的兔抗人CD31抗體、兔抗人AQP1抗體、兔抗人ZO-1、鼠抗人CD133抗體和鼠抗人CD34抗體，4 ℃冰箱孵育過夜。PBS洗滌后，前三者加入鼠抗兔IgG抗體，后兩者加入山羊抗鼠IgG 抗體，均常溫孵育1 h，DAPI 染色后置于倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2.5.3qPCR 操作步驟同2.4.2。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件處理，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 牛角膜內皮細胞形態

原代培養的牛角膜內皮細胞在分離培養24 h后大部分已貼壁，細胞爬行生長至第7天可以達90%融合成片，細胞呈多邊形鋪路石狀，細胞間連接緊密。傳代培養細胞4代以內增殖活躍，形態呈多角形；4代以后形態不規則，胞質增多，細胞間連接松散，見圖1A。

2 iPSCs克隆生長形態及鑒定

iPSCs克隆生長迅速，核質比較一般細胞大，細胞排列緊密，克隆團邊界清晰，約5～7 d克隆團開始與周邊克隆團融合，見圖1B。免疫熒光顯示iPSCs的Oct4和Nanog均表達陽性,見圖1E、F、G、H。

3 單散細胞iPSCs生長及分化形態及鑒定

實驗組和對照組(二)細胞在種板后24 h大部分細胞貼壁，對照組(二)單散iPSCs在第1次換液后隔天觀察細胞幾乎全部不再貼壁，見圖1C。實驗組單散iPSCs換液后細胞貼壁生長，核質比減小，胞漿增多，見圖1D。選用實驗組第3天的單散iPSCs進行免疫熒光檢測顯示,iPSCs的Oct4和Nanog染色均表達陽性，見圖1I、J、K、L。死活細胞染色活細胞被染成綠色，死細胞被染成紅色，實驗組較對照組(二)死細胞少，ImageJ死細胞計數后進行統計學分析，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2A。

qPCR檢測單散iPSCs培養3 d的Oct4、Nanog和Sox2 mRNA表達量同對照組(一)比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2B；但經過14 d共培養誘導后，單散iPSCs的Oct4、Nanog和Sox2 mRNA表達量同對照組(一)比較差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2C。

Figure 1. The morphological characteristics of human iPSCs and bovine CECs. A: the morphology of bovine CECs cultured for 7 d; B: the morphology of iPSCs in control group 1 for 4 d; C: the morphology of single-dissociated iPSCs in control group 2 for 3 d; D: the morphology of single-dissociated iPSCs in experimental group for 3 d; Nanog was positively expressed in iPSCs of control group 1 (E and F), and experimental group (I and J) for 3 d; Oct4 was positively expressed in iPSCs of control group 1 (G and H), and experimental group (K and L) for 3 d. Scale bar=100μm.

Figure 2. The live and dead cell staining (A; scale bar=100 μm) and qPCR detection (B: 3 d; C: 14 d) of human single-dissociated iPSCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs experiment.

經過14 d共培養,實驗組誘導后細胞已達100%融合，細胞形態較均一，多邊形，體積增大，胞漿增多，核漿比減小，無明顯克隆團塊，細胞間連接緊密，見圖3A。對照組(一)細胞形態多樣，細胞間可見多個散在已老化iPSCs克隆團塊，見圖3B。14 d共培養后，ALP染色實驗組染色陰性，對照組(一)可見明顯團塊狀著色，見圖3C、D。免疫熒光染色ZO-1、AQP1和CD31表達陽性，CD34和CD133表達陰性，見圖3E、F、G、H、I。

Figure 3. The morphological characteristics of single-dissociated human iPSCs after 14 d of co-culture with bovine CECs. A: the morphology of single-dissociated iPSCs in experimental group; B: the morphology of iPSCs in control group 1; C: alkaline phosphatase staining was negative in single-dissociated iPSCs in experimental group; D: alkaline phosphatase staining was positive in control group 1; immunofluorescence staining for ZO-1(E), AQP1(F) and CD31(G) was positive, while that for CD34 (H) and CD133(I) was negative in single-dissociated iPSCs after co-culture in experimental group. Scale bar=100 μm.

討 論

目前，iPSCs細胞已成為組織工程細胞的理想來源，通過病毒轉染、蛋白轉導、添加小分子、共培養等方式iPSCs可被誘導為心肌細胞、血管內皮細胞、視網膜色素上皮細胞、神經嵴細胞等[6-9]。全球約半數的角膜移植術用于治療CECs功能失代償導致的角膜盲，CECs是角膜與組織工程角膜的關鍵細胞。將iPSCs細胞誘導分化為角膜內皮細胞，可以為解決眼科臨床治療角膜內皮疾病提供新的途徑。然而，從其它細胞誘導分化為角膜內皮細胞一直是科研工作中的難題，僅有少量文獻報道，其中Hatou等[10]報道運用神經嵴來源的角膜基質干細胞可誘導分化為功能性角膜內皮細胞。Ju等[11]報道運用條件培養基促進神經嵴細胞向角膜內皮樣細胞分化。2篇文獻都是由神經嵴細胞分化，從iPSCs向角膜內皮分化鮮有文獻報道。通常iPSCs在單散細胞、克隆團較小或懸浮狀態下活性明顯降低，不利于分化研究的開展[2]，而iPSCs呈克隆團樣會使分化效率顯著降低[12-14]。如何獲得有利于細胞分化且活性好的單散iPSCs成為一個亟待解決的問題。有文獻通過自配iPSCs培養基來實現單散iPSCs培養，再將單散細胞誘導分化為體細胞,取得了很好的效果，不僅無需細胞分選等復雜操作，而且縮短了誘導時間，誘導分化后細胞形態均一，無明顯iPSCs克隆團存在[15]。也有文獻通過運用小分子non-muscle myosin II增加iPSCs小克隆團、懸浮培養細胞及單散細胞活性[16]。

體細胞與干細胞共培養可以誘導干細胞向該種體細胞表型分化，接觸共培養更可以顯著促進干細胞增殖及分化。Perrier 等[4]報道，人胚胎干細胞與MS5細胞混合接觸共培養后，可以使前者有效地分化為神經上皮樣細胞。Yoshida等[5]發現，小鼠iPSCs與PA6細胞混合接觸共培養后，表達早期外胚層標志KRT14 和 KRT18，出現上皮樣細胞，經過其后的氣液培養后，呈現多層上皮細胞層，底層細胞表達p63。本實驗通過Transwell接觸共培養模型，首次進行iPSCs與CECs共培養研究，有以下發現：(1)使iPSCs在單散狀態下仍然保持較高的活性，與未進行共培養的單散iPSCs比較,死細胞數量顯著減少。(2)使iPSCs在單散狀態下仍然保持高潛能的未分化特性，免疫熒光染色多能性相關蛋白(Oct4和Nanog)表達陽性，Oct4、Nanog和Sox2 mRNA表達與iPSCs克隆團比較差異無統計學意義。(3)Transwell接觸共培養模型既有利于2種細胞接觸互相發揮作用，又使2種細胞分隔而不會混合，不影響細胞的純化效果；因此，這種接觸共培養模型既有利于iPSCs生長，也有利于其分化。(4)與CECs共培養2周促進iPSCs向CECs樣細胞分化，細胞形態均一,呈多角形，表達部分內皮細胞表型(ZO-1、AQP1和CD31)。

本研究實驗發現，Transwell接觸共培養模型可以使單散iPSCs存活且維持iPSCs原有多能性，單散狀態更利于iPSCs分化，通過與角膜內皮細胞共培養可以初步誘導iPSCs向內皮樣細胞分化。我們將在下一步的實驗中，添加促進CECs分化與CECs發育信號的培養液，使iPSCs通過Transwell接觸共培養分化為更成熟穩定的CECs，并用于治療角膜內皮細胞病變。

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