硫化氫通過抑制氧化應激改善高糖誘導的內皮細胞衰老*

宋志明， 王 敏， 劉 勇， 郝寶順， 牛海名， 劉定輝， 余舒杰， 周 彬， 吳 琳， 余顯冠， 凌葉盛， 彭 沛， 朱潔明， 陳 璘， 錢孝賢，2△

(中山大學 1附屬第三醫院心血管內科, 2中西醫結合研究所，廣東 廣州 510630)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病已經成為全球致殘致死最常見的心血管疾病之一，血管內皮細胞功能的障礙則是冠心病發生與發展的重要危險因素[1]。大量臨床研究證實糖尿病患者發生冠心病的風險以及病變嚴重程度都比其他人群嚴重；同時，一些研究發現與年齡相隨的內皮細胞衰老大大促進了血管事件，而高血糖可以加速內皮細胞的衰老[2]。因此，預防高血糖誘導的內皮細胞衰老或許是一個新的治療糖尿病相關性動脈粥樣硬化的靶點。

硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)是第3種在人體內被發現的氣體信號分子，它在維持心血管系統平衡中起到了重要作用[3]。在糖尿病患者以及糖尿病大鼠血液中，它的含量顯著降低，血管內皮功能受損，而如果給予外源性硫化氫，內皮功能有所恢復[4-5]。本研究旨在觀察外源性H2S是否對高糖誘導的內皮細胞衰老具有一定的治療作用，并進一步探討其作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

葡萄糖、甘露糖醇、MTT、NaHS和DMSO購自Sigma-Aldrich。預染蛋白條帶標志購自Fermentas。Ⅰ型膠原酶購自Invitrogen。無血清培養基(serum-free medium, SFM)、M199培養基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibco。內皮細胞生長添加劑(endothelial cell growth supplement, ECGS)購自BD，抗NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1, SOD1)抗體購自Epitomics。抗纖溶酶原激活物抑制劑 1 (plasminogen activator inhibitor 1, PAI-1) 抗體購自Santa Cruz。抗GAPDH內參照抗體購自Proteintech。小鼠及兔Ⅱ抗購自武漢博士德。丙二醛(malondialdehyde, MDA)測試盒購自南京建成，細胞裂解液和蛋白定量試劑盒(BCA法)購自南京凱基。

2 細胞分離培養

取健康無菌新生兒臍帶，PBS沖洗3遍，然后用0.1%膠原酶(Ⅰ型)消化15 min，收集膠原酶細胞混合液，1 200 r/min離心5 min，棄上清，加完全培養基(20%FBS、20%SFM和60 mg/L ECGS)混勻種于培養瓶里培養。實驗中所使用細胞為1～3代。

3 流式細胞術檢測

收取第1代內皮細胞，交由中山大學附屬第一醫院實驗室用流式細胞儀檢測細胞表面標志物CD31。

4 內皮細胞衰老模型的建立

內皮細胞在6孔板內生長至70%時，加入33 mmol/L葡萄糖培養48 h[6]。通過衰老相關β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)染色和衰老標志物PAI-1的檢測判斷模型成功與否。SA-β-Gal染色參照Liu等[7]研究的方法進行。PAI-1的檢測方法參見免疫蛋白印跡部分。

5 細胞存活率的測定

內皮細胞接種于96孔板中，每孔4 000個細胞，24 h后根據實驗需要進行不同處理，每個處理因素設5個復孔。處理結束后，每孔加入20 μL 5 g/L MTT培養4 h；去除培養基后，每孔加入150 μL DMSO，用錫箔紙遮蓋后置于搖床上15 min充分搖勻。最后在490 nm處，用酶標儀讀取各孔的吸光度值(A)。

6 免疫蛋白印跡

6.1蛋白提取 細胞處理結束后，吸去培養基，用預冷的PBS沖洗2遍，每孔加70 μL細胞裂解液，放于冰上孵育15 min，用細胞刮刮下細胞，將細胞裂解物吸至預冷的1.5 mL離心管中，13 200 r/min 4 ℃離心15 min；小心吸取上清，分裝保存于-80 ℃。

6.2Western blotting 經BCA定量后，總蛋白進行SDS-PAGE 電泳，然后轉移到NC膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入相應抗體，4 ℃搖床過夜孵育；棄去Ⅰ抗，TBST洗3次，每次5 min，加入小鼠或兔Ⅱ抗，室溫孵育1 h后，TBST洗3次后ECL顯影，最后用Quantity One 軟件分析蛋白條帶。

7 MDA含量測定

采用硫代巴比妥酸法測定細胞培養液中的MDA含量，操作過程嚴格按照說明書進行。

8 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件分析，定量資料用均數±標準差(mean±SD)表示。組間均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HUVECs的鑒定

流式細胞術檢測表明第1代內皮細胞CD31抗原陽性率99.92%，符合內皮細胞特性，見圖1。

Figure 1. Positive rate of CD31 on the surfaces of cells detected by flow cytometry.A: negative control; B: passage 1 cells.

2 高糖誘導的衰老模型

內皮細胞生長至70%時，加入33 mmol/L葡萄糖或甘露醇，繼續培養48 h。結果發現高糖組(HG組)細胞生長緩慢，形態扁平，PAI-1蛋白表達大幅度增加，SA-β-Gal染色陽性細胞增加，與正常對照組(5 mmol/L 葡萄糖，Con組)及高滲對照組(mannitol，M組)相比具有顯著差異，而高滲組與正常組之間無顯著差異，見圖2A、B。同時，MTT結果顯示，與2個對照組相比，高糖組細胞數目明顯減少(P<0.05)，見圖2C。所以，高糖作用內皮細胞48 h可以成功誘導衰老模型。

Figure 2. Effects of high glucose on cell senescence and viability. A: Western blotting of PAI-1 and normalized ana-lysis of intensity; B: images of SA-β-Gal staining (×100); C: the cell viability detected by MTT assay.Con: control group; M: mannitol group; HG: high glucose group.Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs M group.

3 不同濃度NaHS對細胞活性的影響

內皮細胞接種于96孔板，生長24 h后，分別給予50、100、200和500 μmol/L NaHS。48 h后，MTT檢測發現，除了500 μmol/L NaHS外，其它濃度對內皮細胞的生長均沒有影響，見圖3。所以，以后的實驗就選用50、100和200 μmol/L 3個濃度對細胞進行干預。

Figure 3. The effect of different concentrations of NaHS on cell viability. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs 0 μmol/L group.

4 NaHS對高糖刺激后細胞生長的作用

內皮細胞生長至60%時分別給予50、100和200 μmol/L NaHS，共同孵育6 h后，相應加入葡萄糖或甘露醇。培養48 h后，MTT結果發現與高糖組相比，除50 μmol/L NaHS沒有顯著差異外，100和200 μmol/L NaHS都能明顯增加細胞數目(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. NaHS influenced cell viability under high glucose condition.HG: high glucose; HG+50: high glucose plus 50 μmol/L NaHS; HG+100: high glucose plus 100 μmol/L NaHS; HG+200: high glucose plus 200 μmol/L NaHS. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs HG group.

5 NaHS對高糖誘導內皮細胞衰老的影響

通過對PAI-1蛋白檢測發現，NaHS單獨干預組對PAI-1蛋白表達無顯著影響，100和200 μmol/L NaHS均能顯著減少高糖誘導的PAI-1蛋白表達，而50 μmol/L NaHS尚不能降低PAI-1蛋白表達,見圖5。同時，SA-β-Gal染色結果也證實了100和200 μmol/L NaHS能明顯減少SA-β-Gal陽性細胞數目,見圖6。綜合圖4～6的結果，100和200 μmol/L NaHS能很好地減輕高糖誘導的內皮細胞衰老。在后續研究NaHS對衰老的作用時，只是選擇了100和200 μmol/L 這2個濃度。

6 NaHS對SOD1表達的影響

高糖誘導的衰老主要是通過氧化應激作用產生的，而SOD1是生物體內重要的抗氧化物酶，是清除生物體內自由基的首要物質，具有抵抗衰老的效果。Western blotting檢測發現與HG組比較，100和200 μmol/L NaHS均能顯著提高SOD1的表達，見圖7。

Figure 5. The effect of NaHS on PAI-1 expression.M: mannitol; NaHS: 200 μmol/L NaHS; HG: high glucose; HG+50: high glucose plus 50 μmol/L NaHS; HG+100: high glucose plus 100 μmol/L NaHS; HG+200: high glucose plus 200 μmol/L NaHS.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs M group; #P<0.05 vs HG group.

Figure 6. The effect of NaHS on SA-β-Gal activity(×100).M: mannitol; NaHS: 200 μmol/L NaHS; HG: high glucose; HG+50: high glucose plus 50 μmol/L NaHS; HG+100: high glucose plus 100 μmol/L NaHS; HG+200: high glucose plus 200 μmol/L NaHS.

7 NaHS對細胞MDA含量的影響

與正常對照相比，高糖組MDA的含量增加了1倍多(P<0.01)。而NaHS則顯著降低了MDA的含量(P<0.05)，見圖8。

8 NaHS對NF-κB p65的影響

結果顯示高糖組NF-κB p65的活性明顯增加，而NaHS顯著降低了其活性，見圖9。

討 論

本課題研究發現，高糖能夠誘導原代臍靜脈內皮細胞的衰老，而100和200 μmol/L NaHS能顯著減輕高糖誘導的衰老。細胞衰老是細胞隨著生物體年齡增長而發生的退行性變化的一種病理狀態，分為生理性的自發性衰老和病理性的應激誘導的早熟型衰老；許多的刺激因素可以誘導或加速細胞衰老，比如低密度脂蛋白膽固醇、高糖、過氧化氫等[2, 7]。

Figure 7. The effect of NaHS on SOD1 expression.M: mannitol; NaHS: 200 μmol/L NaHS; HG: high glucose; HG+100: high glucose plus 100 μmol/L NaHS; HG+200: high glucose plus 200 μmol/L NaHS.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs M group; #P<0.05 vs HG group.

Figure 8. The effect of NaHS on MDA level.M: mannitol; NaHS: 200 μmol/L NaHS; HG: high glucose; HG+100: high glucose plus 100 μmol/L NaHS; HG+200: high glucose plus 200 μmol/L NaHS.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs M group; #P<0.05 vs HG group.

內皮細胞功能障礙在各種糖尿病并發癥的發生發展中起到了重要作用，也是高血糖長期作用的結果[8-9]。因此，高血糖誘導的內皮細胞衰老，對于研究糖尿病疾病狀態下細胞功能的改變具有重要意義。

氧自由基學說是目前較為普遍接受的細胞衰老的一個重要機制。在糖尿病或者高血糖狀態下，生物體內活性氧自由基的產生增加[10]。而SOD1是體內重要的自由基清除劑，它可以消除體內氧自由基并能抗脂質過氧化，阻斷自由基對組織的損傷作用。

Figure 9. The effect of NaHS on the activation of NF-κB p65.M: mannitol; NaHS: 200 μmol/L NaHS; HG: high glucose; HG+100: high glucose plus 100 μmol/L NaHS; HG+200: high glucose plus 200 μmol/L NaHS.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs M group; #P<0.05, ##P<0.01 vs HG group.

本研究發現，高糖誘導的衰老內皮細胞中，SOD1的表達明顯減少，與此同時脂質過氧化物MDA含量增加，這表明高糖可以通過提高細胞內氧化應激誘導內皮細胞衰老。

NF-κB p65是NF-κB家族重要的一個亞單位，是其發揮功能的必需亞單位，它在調控炎癥反應中具有重要的作用；近年來，大量的研究發現它在衰老中同樣具有重要的作用，NF-κB p65不但在衰老組織或細胞中活性增加，而且抑制它的活性可以減輕或者減緩衰老[11-12]。

H2S是繼一氧化碳和一氧化氮之后在人體內發現的第3種內源性氣體信號分子。近年來，越來越多的研究證實，H2S在人體心血管及神經系統中具有重要的保護作用；然而在糖尿病患者中，H2S的含量相比正常人群明顯降低[3]。在對糖尿病動物的研究中發現，給予外源性H2S能夠減輕糖尿病機體的損傷[13-15]。同時，有研究證實外源性H2S可以延緩過氧化氫誘導的內皮細胞衰老[16]。本研究證實了H2S可以減少MDA含量，上調SOD1的表達，抑制NF-κB p65的活化，進而減輕了高糖誘導的內皮細胞衰老。我們的研究也進一步豐富了H2S對于改善高糖所造成內皮細胞損傷的機制。

本研究結果提示，H2S能通過抑制氧化應激和NF-κB p65 的活性，抵抗高糖誘導的HUVECs衰老。當然，這需要更多的體外研究和一系列臨床試驗去論證，而外源性H2S減輕高血糖所誘導加速的內皮細胞衰老的機制仍需進一步探討。

[參 考 文 獻]

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