橡膠樹膠孢炭疽菌細(xì)胞自噬相關(guān)基因CgAtg4的克隆與序列分析

翟李剛+林春花+蔡志英+時(shí)濤+黃貴修

摘要：細(xì)胞自噬（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ）有助于植物病原真菌渡過營養(yǎng)饑餓、供氧不足等不良環(huán)境，有研究發(fā)現(xiàn)其與植物病原真菌的致病性相關(guān)。利用橡膠膠孢炭疽菌ＨＢＣｇ０１全基因組數(shù)據(jù)庫，采用ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ克隆細(xì)胞自噬相關(guān)基因ＣｇＡtg４（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登錄號(hào)：ＫＣ７３５１２５），并對(duì)其序列進(jìn)行分析，研究細(xì)胞自噬在膠孢炭疽菌侵染橡膠樹過程中的作用。結(jié)果表明，ＣｇＡtg４的開放閱讀框（ＯＲＦ）為９６０ ｎｔ，編碼３１９個(gè)ａａ序列，預(yù)測含有一個(gè)由２１３個(gè)ａａ組成的高度保守的Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４蛋白酶結(jié)構(gòu)域，與另外１９種真菌的Ａtg４氨基酸序列同源性為３８％～８７％。推測ＣｇＡtg４可能與橡膠樹膠孢炭疽病菌的產(chǎn)孢能力、分生孢子萌發(fā)以及附著胞膨壓的形成相關(guān)。

關(guān)鍵詞：橡膠樹；膠孢炭疽菌；自噬相關(guān)基因；ＣｇＡtg４

中圖分類號(hào)：Ｓ４３２．４＋４；Q75文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０14）09－2189-03

Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ ＣｇＡtg４ ｆｒｏｍ

Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ｏｆ Ｒｕｂｂｅｒ Tree

ＺＨＡＩ Ｌｉ－ｇａｎｇ１，２，ＬＩＮ Ｃｈｕｎ－ｈｕａ１，ＣＡＩ Ｚｈｉ－ｙｉｎｇ１，ＳＨＩ Ｔａｏ１，ＨＵＡＮＧ Ｇｕｉ－ｘｉｕ１

（１．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ/Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｎ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｒｏｐｓ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ/Ｈａｉｎａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｅｓｔｓ，Ｈａｉｋｏｕ ５７１１０１， Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｃａｎ ｈｅｌｐ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ｓｕｒｖｉｖｅ ｉｎ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｈｕｎｇｅｒ， ｏｘｙｇｅｎ ｈｕｎｇｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ. ａｎｄ It is found to be ｒｅｌａｔｅｄ with ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｓｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈes． Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ explore ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ， ｔｈｅ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ＣｇＡtg４（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ｎｕｍｂｅｒ：ＫＣ７３５１２５） ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ database of ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ＨＢＣｇ０１ ｇｅｎｏｍｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ that ｔｈｅ ＣｇＡtg４ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ） ｗａｓ ９６０ ｎｔ， ｃｏｄｉｎｇ ３１９ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅ with ａ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４ ｗｉｔｈ ２１３ ａａ． Ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ＣｇＡtg４ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ Ａtg４ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ １９ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｆｕｎｇａｌｓ was ３８％ ｔｏ ８７％． Ｉｔ ｉｓ predictal that ＣｇＡtg４ ｇｅｎｅ is ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ， ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅ ｇｅｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ ｔｕｒｇｏｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ of rubber tree Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ； Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ； ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ； ＣｇＡtg４

細(xì)胞自噬（Autophagy）是真核生物中廣泛存在的作用機(jī)制，且在進(jìn)化上十分保守，它是真核生物中對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要過程，該過程中一些損壞的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，送入溶酶體或液泡中進(jìn)行降解并得以循環(huán)利用。自噬過程中最為重要的兩個(gè)環(huán)節(jié)是自噬過程的誘導(dǎo)和自噬體的形成，參與此過程的至少有１７個(gè)Ａｔｇ（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，細(xì)胞自噬相關(guān)）蛋白，被分為５個(gè)功能組［１］：Ⅰ．Ａｔｇ１激酶功能組（Ａｔｇ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）；Ⅱ．Ａｔｇ９膜蛋白循環(huán)系統(tǒng)（Ａｔｇ９ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）；Ⅲ．Ａｔｇ８－磷脂酰乙醇胺（ＰＥ）功能組（Ａｔｇ８ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）；Ⅳ．Ａｔｇ１２－Ａｔｇ５復(fù)合體功能組（Ａｔｇ１２－Ａｔｇ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）；Ⅴ．磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白３（ＰｔｄＩｎｓ３）－激酶復(fù)合體（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ－３ ｋｉｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）。Ａｔｇ４基因?qū)儆冢粒簦纾福字Ｒ掖及罚ǎ校牛┕δ芙M，該基因能切割Ａｔｇ８羧基端的精氨酸，暴露出甘氨酸［２］，并在Ａｔｇ７和Ａｔｇ３的共同調(diào)節(jié)作用下形成Ａｔｇ８蛋白與磷脂酰乙醇胺復(fù)合物（Ａｔｇ８－ＰＥ），從而促進(jìn)自噬體前體膜的聚集和融合［３］，進(jìn)一步形成自噬體。

炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）是一類常見且最重要的植物病原真菌之一，引起各種農(nóng)作物炭疽病，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失［４］。炭疽病已成為研究植物病原真菌生長發(fā)育、侵染過程及植物與病原菌互作機(jī)制的典型材料。由膠孢炭疽菌［Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ （Ｐｅｎｚｉｇ） Ｐｅｎｚｉｇ ｅｔ Ｓａｃｃａｒｄｏ］侵染引起的橡膠樹炭疽病［５］是橡膠樹重要葉部病害之一。該病可危害橡膠小苗、大田幼樹直至成齡開割樹，侵染葉片、葉柄和果實(shí)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起橡膠樹的重復(fù)落葉和嫩梢回枯，推遲開割時(shí)間［６］。至今，未見炭疽菌細(xì)胞自噬相關(guān)基因的報(bào)道。本研究在橡膠樹膠孢炭疽菌全基因組測序的基礎(chǔ)上，以細(xì)胞自噬基因家族中與自噬體形成相關(guān)的Ａｔｇ４基因?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)其進(jìn)行基因克隆和序列分析，為后續(xù)的基因功能鑒定提供參考。

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１材料與方法

１．１供試材料

供試橡膠樹膠孢炭疽病菌菌株ＨＢＣｇ０１，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所分離自海南省儋州市發(fā)病橡膠樹葉片。橡膠樹品種熱研７－３３－９７，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所提供。

１．２試劑

ＨＢＣｇ０１病菌培養(yǎng)采用ＰＤＡ培養(yǎng)基，參照方中達(dá)［６］的方法制備。試劑：ＤＮＡ片段膠回收試劑盒、ｐＭＤ１８－Ｔ載體、ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ購自寶生物工程（大連）有限公司；Ｔａｑ酶和ｄＮＴＰ購自天根生化科技（北京）有限公司；大腸桿菌Ｔ１感受態(tài)細(xì)胞和ＲＮＡ提取試劑盒ＴｒａｎｓＺｏｌ Ｐｌａｎｔ購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

１．３方法

１．３．１引物設(shè)計(jì)在ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）數(shù)據(jù)庫中搜索近源物種的Ａtg４基因序列，在ＨＢＣｇ０１全基因組數(shù)據(jù)庫中分別進(jìn)行本地Ｂｌａｓｔ檢索，獲得ＨＢＣｇ０１中的同源基因，根據(jù)５′端和３′端序列設(shè)計(jì)１對(duì)引物ＡＴＧ４－Ｆ和ＡＴＧ４－Ｒ。

１．３．２ＨＢＣｇ０１基因組ＤＮＡ、ＲＮＡ提取和ｃＤＮＡ的合成菌株在ＰＤＡ平板上２８ ℃培養(yǎng)７ ｄ后，收集菌絲。采用ＣＴＡＢ法［７］提取基因組ＤＮＡ。采用ＴｒａｎｓＺｏｌ Ｐｌａｎｔ和ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ試劑盒，參照說明書中相關(guān)步驟進(jìn)行ＲＮＡ提取，去除基因組ＤＮＡ和ＲＮＡ的反轉(zhuǎn)錄。

１．３．３Ａtg４基因的ＰＣＲ擴(kuò)增、克隆與序列分析 以ＨＢＣｇ０１基因組ＤＮＡ和ｃＤＮＡ為模板，用引物對(duì)ＡＴＧ４－Ｆ和ＡＴＧ４－Ｒ進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：１０×ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）４ μＬ，ＭｇＣｌ２ ３ μＬ，１０ μｍｏｌ／Ｌ上下游引物各２ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ酶（５ Ｕ／μＬ）０．５ μＬ，模板ＤＮＡ／ｃＤＮＡ ２ μＬ，加水補(bǔ)足至５０ μＬ。反應(yīng)條件為：９４ ℃預(yù)變性５ ｍｉｎ，９４ ℃變性４５ ｓ，６０ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５個(gè)循環(huán)，７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)１％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收目的片段。

擴(kuò)增產(chǎn)物回收后克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ載體上。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，采用堿裂解法［8］提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒ＤＮＡ，經(jīng)ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ雙酶切鑒定、菌落ＰＣＲ鑒定后，隨機(jī)挑選３個(gè)陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測定，確認(rèn)序列后在ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ上進(jìn)行比較分析，并預(yù)測相應(yīng)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域。采用ＤＮＡＭＡＮ軟件將測序的核酸序列翻譯成氨基酸序列，并在ＮＣＢＩ上對(duì)其進(jìn)行Ｂｌａｓｔｐ檢索，下載其他近源真菌的同源氨基酸序列，用ＭＥＧＡ Vｅｒｓｉｏｎ ４．０軟件中的ＮＪ（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）方法生成系統(tǒng)樹，用Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗(yàn)，１ ０００次重復(fù)。

２結(jié)果與分析

２．１引物的設(shè)計(jì)

利用稻瘟菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ）Ａｔｇ４基因（ＡＣＪ０６５８７．１）的ａａ序列和菌株ＨＢＣｇ０１的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行本地Ｂｌａｓｔ，結(jié)果表明該菌株中有一個(gè)預(yù)測的同源基因，分析其大小約１．１ ｋｂ，命名為ＣｇＡｔｇ４。根據(jù)該基因的５′端和３′端序列設(shè)計(jì)了１對(duì)引物ＡＴＧ４－Ｆ（５′－ＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＴＣ－３′）、ＡＴＧ４－Ｒ（５′－ＧＧＴＡＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＣＣＴ３－′）。

２．２橡膠樹膠孢炭疽菌ＣｇＡｔｇ４基因的克隆

利用引物ＡＴＧ４－Ｆ和ＡＴＧ４－Ｒ對(duì)ＨＢＣｇ０１的基因組ＤＮＡ和ｃＤＮＡ進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，分別得到約１．１ ｋｂ和１．０ ｋｂ的條帶（圖１），與預(yù)期的條帶大小一致。測序結(jié)果顯示，以基因組ＤＮＡ為模板擴(kuò)增得到的產(chǎn)物大小為１ １２９ kb，以ｃＤＮＡ為模板擴(kuò)增得到的產(chǎn)物大小為９６０ kb。

２．３ＣｇＡｔｇ４基因的序列分析

生物信息學(xué)分析表明，ＣｇＡｔｇ４基因含有一個(gè)完整的開放閱讀框（ＯＲＦ），含有３個(gè)外顯子和２個(gè)內(nèi)含子，編碼３１９個(gè)ａａ殘基，分子量約為３５．０１ ｋＤ，等電點(diǎn)PＩ為５．１４，含有１１６個(gè)疏水性殘基和２０３個(gè)親水性殘基，預(yù)測蛋白質(zhì)中含有一個(gè)由２１３個(gè)ａａ組成的高度保守的Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４蛋白酶結(jié)構(gòu)域（圖２）。該序列已提交ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為ＫＣ７３５１２５。

在ＮＣＢＩ上將ＣｇＡtg４氨基酸序列進(jìn)行Ｂｌａｓｔｐ檢索，下載１９個(gè)菌株的Ａtg４基因氨基酸序列，利用ＭＥＧＡ Vｅｒｓｉｏｎ ４．０軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖３）。結(jié)果表明，ＣｇＡｔｇ４與膠孢炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ，ＥＬＡ２５６００．１）、菜心炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ，ＣＣＦ３９２７１．１）以及小叢殼屬真菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ ＥＦＱ３６７５０．１）的同源性相對(duì)較高，分別為８７％、７８％和８０％，親緣關(guān)系最近；與黏紅酵母（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ，ＥＧＵ１３５８７．１）和釀酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，ＥＤＺ６９８０６．１）的Ａｔｇ４氨基酸序列同源性較低，分別為４３％和３８％，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

３討論

１９６２年，Ａｓｈｆｏｒｄ等［９］用電子顯微鏡在人的肝細(xì)胞中首次觀察到細(xì)胞自噬現(xiàn)象。關(guān)于該現(xiàn)象調(diào)控機(jī)制方面的研究較少，其作用機(jī)理尚不清楚。上世紀(jì)９０年代以來，酵母作為一種模式生物受到了關(guān)注，研究者開展了大量的自噬作用機(jī)制研究。目前，已發(fā)現(xiàn)３０多個(gè)基因參與酵母的自噬作用，其中１７個(gè)基因參與自噬泡的形成［１０］。

近年來有研究表明，細(xì)胞自噬過程與病原真菌的致病性密切相關(guān)。在稻瘟菌中，細(xì)胞自噬過程與稻瘟病菌的產(chǎn)孢、附著胞膨壓、穿透、致病性以及有性生殖等各個(gè)發(fā)育階段密切相關(guān)［１１，１２］。缺失ＭｇＡｔｇ４基因后，稻瘟菌突變體菌絲稀疏、產(chǎn)孢量下降、附著胞膨壓降低，而且孢子萌發(fā)和附著胞形成延遲，接種大麥和水稻均不能形成病斑［１３］。ＣｇＡｔｇ４和ＭｇＡｔｇ４所編碼的氨基酸序列具有６１％的同源性，都包含一個(gè)高度保守的Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４蛋白酶結(jié)構(gòu)域，推測ＣｇＡｔｇ４基因參與菌絲生長、產(chǎn)孢和侵染過程。

本研究成功克隆得到橡膠樹膠孢炭疽菌與細(xì)胞自噬相關(guān)的ＣｇＡｔｇ４基因，利用ＮＣＢＩ分析其具有高度保守的Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４蛋白酶結(jié)構(gòu)域。基于該基因的ａａ序列，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，分析了該基因氨基酸序列和其他真菌同源基因的親緣關(guān)系。本研究為進(jìn)一步研究ＣｇＡｔｇ４基因在橡膠樹膠孢炭疽病菌自噬過程中的作用等提供了基礎(chǔ)，有助于從分子生物學(xué)層面研究細(xì)胞自噬與橡膠樹膠孢炭疽菌致病性的關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 劉小紅，魯書玲，林福呈．細(xì)胞自噬的基因調(diào)控及其與稻瘟病的關(guān)系［Ｊ］．細(xì)胞生物學(xué)雜志，２００８，３０（６）：７３７－７４１．

［２］ ＫＩＲＩＳＡＫＯ Ｔ， ＢＡＢＡ Ｍ， ＩＳＨＩＨＡＲＡ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ ｉｓ ｔｒａｃｅｄ ｗｉｔｈ Ａｔｇ８／Ａｕｔ７ｐ ｉｎ ｙｅａｓｔ［Ｊ］． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Cｅｌｌ Bｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１４７（２）：４３５－４４６．

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［３］ ＶＥＮＥＡＵＬＴ－ＦＯＵＲＲＥＹ Ｃ， ＢＡＲＯＯＡＨ Ｍ， ＥＧＡＮ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｆｕｎｇａｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１２（５７７３）：５８０-583．

［４］ 唐建輝，王偉．西瓜炭疽菌核糖體基因ＩＴＳ區(qū)段的克隆及序列分析［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００７，３５（９）：２５６６－２５６８．

［５］ 黃貴修，許燦光．中國天然橡膠病蟲草害識(shí)別與防治［Ｍ］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，２０１２．

［６］ 方中達(dá)．植病研究方法［Ｍ］．第３版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，１９９８．

［７］ 易潤華，朱西儒，周而勛．簡化ＣＴＡＢ法快速微量提取絲狀真菌ＤＮＡ［Ｊ］． 湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，２００３，２３（６）：７２－７３．

［８］ 孟宇，李靜，孫智峰，等．經(jīng)典堿裂解法質(zhì)粒大量提取方法的改良［Ｊ］．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，２０１２，24（2）：３３－３５．

［９］ ＡＳＨＦＯＲＤ Ｔ Ｐ，ＰＯＲＴＥＲ Ｋ Ｒ． Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Cｅｌｌ Bｉｏｌｏｇｙ，１９６２，１２（１）： １９８－２０２．

［１０］ ＫＬＩＯＮＳＫＹ Ｄ Ｊ． Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ： Rｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｅｌｆ－ｃａｎｎｉｂａｌｉｓｍ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３１：３１－３２．

［１１］ ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ， ＺＨＡＮＧ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ， ＭｇＡＴＧ１， ｉｎ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ ｔｕｒｇｏｒ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ， ２００７，６（６）：９９７－１００５．

［１２］ ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ，ＬＩＮ Ｆ Ｃ． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ， ｃｏｎｉｄｉａｌ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｒｇｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ［Ｊ］． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，２００７，３（５）：４７２－４７３．

［１３］ ＬＩＵ Ｔ Ｂ， ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ＭｏＡｔｇ４ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＭｏＡｔｇ８ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ［Ｊ］． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ， ２０１０，６（１）：７４－８５．

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［３］ ＶＥＮＥＡＵＬＴ－ＦＯＵＲＲＥＹ Ｃ， ＢＡＲＯＯＡＨ Ｍ， ＥＧＡＮ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｆｕｎｇａｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１２（５７７３）：５８０-583．

［４］ 唐建輝，王偉．西瓜炭疽菌核糖體基因ＩＴＳ區(qū)段的克隆及序列分析［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００７，３５（９）：２５６６－２５６８．

［５］ 黃貴修，許燦光．中國天然橡膠病蟲草害識(shí)別與防治［Ｍ］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，２０１２．

［６］ 方中達(dá)．植病研究方法［Ｍ］．第３版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，１９９８．

［７］ 易潤華，朱西儒，周而勛．簡化ＣＴＡＢ法快速微量提取絲狀真菌ＤＮＡ［Ｊ］． 湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，２００３，２３（６）：７２－７３．

［８］ 孟宇，李靜，孫智峰，等．經(jīng)典堿裂解法質(zhì)粒大量提取方法的改良［Ｊ］．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，２０１２，24（2）：３３－３５．

［９］ ＡＳＨＦＯＲＤ Ｔ Ｐ，ＰＯＲＴＥＲ Ｋ Ｒ． Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Cｅｌｌ Bｉｏｌｏｇｙ，１９６２，１２（１）： １９８－２０２．

［１０］ ＫＬＩＯＮＳＫＹ Ｄ Ｊ． Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ： Rｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｅｌｆ－ｃａｎｎｉｂａｌｉｓｍ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３１：３１－３２．

［１１］ ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ， ＺＨＡＮＧ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ， ＭｇＡＴＧ１， ｉｎ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ ｔｕｒｇｏｒ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ， ２００７，６（６）：９９７－１００５．

［１２］ ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ，ＬＩＮ Ｆ Ｃ． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ， ｃｏｎｉｄｉａｌ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｒｇｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ［Ｊ］． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，２００７，３（５）：４７２－４７３．

［１３］ ＬＩＵ Ｔ Ｂ， ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ＭｏＡｔｇ４ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＭｏＡｔｇ８ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ［Ｊ］． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ， ２０１０，６（１）：７４－８５．

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［３］ ＶＥＮＥＡＵＬＴ－ＦＯＵＲＲＥＹ Ｃ， ＢＡＲＯＯＡＨ Ｍ， ＥＧＡＮ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｆｕｎｇａｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１２（５７７３）：５８０-583．

［４］ 唐建輝，王偉．西瓜炭疽菌核糖體基因ＩＴＳ區(qū)段的克隆及序列分析［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００７，３５（９）：２５６６－２５６８．

［５］ 黃貴修，許燦光．中國天然橡膠病蟲草害識(shí)別與防治［Ｍ］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，２０１２．

［６］ 方中達(dá)．植病研究方法［Ｍ］．第３版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，１９９８．

［７］ 易潤華，朱西儒，周而勛．簡化ＣＴＡＢ法快速微量提取絲狀真菌ＤＮＡ［Ｊ］． 湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，２００３，２３（６）：７２－７３．

［８］ 孟宇，李靜，孫智峰，等．經(jīng)典堿裂解法質(zhì)粒大量提取方法的改良［Ｊ］．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，２０１２，24（2）：３３－３５．

［９］ ＡＳＨＦＯＲＤ Ｔ Ｐ，ＰＯＲＴＥＲ Ｋ Ｒ． Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Cｅｌｌ Bｉｏｌｏｇｙ，１９６２，１２（１）： １９８－２０２．

［１０］ ＫＬＩＯＮＳＫＹ Ｄ Ｊ． Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ： Rｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｅｌｆ－ｃａｎｎｉｂａｌｉｓｍ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３１：３１－３２．

［１１］ ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ， ＺＨＡＮＧ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ， ＭｇＡＴＧ１， ｉｎ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ ｔｕｒｇｏｒ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ， ２００７，６（６）：９９７－１００５．

［１２］ ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ，ＬＩＮ Ｆ Ｃ． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ， ｃｏｎｉｄｉａｌ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｒｇｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ［Ｊ］． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，２００７，３（５）：４７２－４７３．

［１３］ ＬＩＵ Ｔ Ｂ， ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ＭｏＡｔｇ４ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＭｏＡｔｇ８ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ［Ｊ］． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ， ２０１０，６（１）：７４－８５．

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