原生質體誘變提高亞麻刺盤孢ST對底物DHEA的 耐受性和轉化率

李恒，吳燕，魏利莎，李會，張曉梅，史勁松，許正宏

（江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122）

屈螺酮是一種高效、低毒、無副作用的新一代女用口服避孕藥[1]。由于屈螺酮具有廣闊的市場應用前景，其重要的前體化合物三羥基雄甾烯酮（7α，15α-diOH-DHEA）受到了廣泛的關注。目前，7α，15α-diOH-DHEA的主要生產方法是化學合成法，存在反應步驟繁瑣、產物得率低、環境污染嚴重等問題。20世紀70年代，德國先令公司（Schering AG）首次將生物轉化法應用于屈螺酮的合成研究，利用微生物的羥化酶系統，在去氫表雄酮（DHEA）的C7、C15位雙羥化得到7α,15α-diOH-DHEA，但轉化率一直比較低，限制了其大規模的工業化應用。目前對DHEA具有轉化能力的菌株主要來自Mucorracemosus、Fusarium moniliforme和Colletotrichumlini這幾個菌屬，其中以C. lini的催化活性最為顯著[2-3]。但高濃度的DHEA對C. lini具有明顯的毒害作用，因此，如何提高菌株底物耐受性，是實現高底物投料濃度和高轉化效率必須要解決的一個 問題。

由于C. lini的遺傳背景不清晰，因此非理性誘變育種是提高C. lini底物耐受性的首選。但絲狀真菌細胞壁成分復雜，直接以孢子或菌絲體為誘變對象，誘變劑很難直接接觸其遺傳物質，造成突變率低且陽性突變株較少。自1953年Weibull首次用溶菌酶酶解分離到Bacillus megaterium的原生質體之后，更多的研究人員開始利用原生質體誘變技術選育菌種，已有利用原生質體誘變選育高產菌株的 實例[4-7]。

本研究以實驗室保存的Colletotrichum liniST為出發菌株，研究其原生質體的制備和再生方法后，利用等離子誘變（ARTP）處理原生質體。通過抗性平板初篩和HPLC復篩，最終獲得了一株遺傳穩定性良好、底物耐受性較高的優勢突變菌株，并考察了其轉化特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

亞麻刺盤孢ST，由本實驗室保藏。

1.1.2 培養基

發酵培養基（g/L）：葡萄糖 15，酵母粉 15，玉米漿 3。種子培養基加10g/L豆餅粉。

PDA培養基（g/L）：馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂 20。

再生培養基（g/L）：馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂 5，滲透壓穩定劑，在最佳培養條件研究時，組分及濃度進行相應調整。

FM培養基（g/L）：葡萄糖 15，酵母粉 15，玉米漿 3，瓊脂5。

査氏培養基（g/L）：NaNO33，K2HPO41，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01， 蔗糖 30，瓊脂 8。

1.1.3 試劑

DHEA、7α,15α-diOH-DHEA標準品，購自浙江仙居君業藥業有限公司；7α-OH-DHEA標準品由本實驗室分離制備；纖維素酶、蝸牛酶、溶菌酶均購自上海生物工程公司；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌絲體的收集

將PDA斜面保存的亞麻刺盤孢菌絲體接種于無菌種子培養基，30℃、220r/min條件下培養24h，隨后以10%的接種量接入30mL/250mL發酵培養基，同樣條件下培養至對數期，12000r/min離心10min收集菌絲體，用于后續原生質體的制備。

1.2.2 原生質體的制備與再生

將收集的對數期菌絲體用滲透壓穩定劑洗滌離心一次，加入適量的酶解液于水浴鍋中酶解。過濾除菌體碎片后，酶解液離心棄上清，原生質體用滲透壓穩定劑洗滌2次，重懸于1mL滲透壓穩定劑中。制備的原生質體稀釋104倍數后，采用傾倒法再生，其再生率計算如式（1）。

1.2.3 原生質體釋放過程

原生質體稀釋一定的倍數后，利用血球計數法計數。酶解過程每隔0.5h取樣，于顯微鏡下觀察原生質體的形態及釋放過程。

1.2.4 原生質體誘變與優勢突變株的篩選

C. liniST原生質體經ARTP照射后進行再生培養，以不經誘變的原生質體作為對照，計算誘變致死率，如式（2）。同時以底物濃度梯度為篩子進行抗性平板篩選，以不含底物的平板作為對照，計算底物致死率，如式（3）。從含有高濃度底物的抗性平板中挑取單菌落發酵培養后轉化DHEA，測定7α，15α-diOH-DHEA得率，篩選優勢突變株并保種。

1.2.6 突變株的評價

遺傳穩定性考察：將突變株進行連續傳代，測定產物7α,15α-diOH-DHEA得率，并以第一代為對照進行比較。

底物耐受性考察：將突變菌株與出發菌株在發酵培養基中培養24h后，分別加入不同濃度的DHEA繼續培養24h。取1mL培養液過濾獲得孢子，稀釋一定倍數后涂布于PDA培養基，根據再生單菌落數計算菌體對DHEA的耐受性。其計算方法如 式（4）。

轉化過程分析：將種子液按10%接種量轉接到發酵培養基中，220r/min、30℃培養24h。隨后向發酵液中投入10g/L DHEA，繼續轉化72h，測定轉化過程曲線。

1.2.7 分析方法

采用高效液相色譜法（HPLC）檢測DHEA、7α-OH-DHEA、7α,15α-diOH-DHEA的濃度。色譜柱，Agilent TC-C18 （4.6mm×250mm，5μm）；流動相，乙腈/水（7∶3，體積比）；柱溫30℃；檢測波長206nm；流速0.5mL/min；進樣量10μL。產物得率計算方法如式（5）。

式中，C1為HPLC檢測的7α,15α-diOH-DHEA濃度；C2為HPLC檢測的DHEA濃度。

2 實驗結果與分析

2.1 原生質體的制備

2.1.1 酶濃度對原生質體制備的影響

不同種類微生物在制備原生質體時所需酶的種類和濃度不同。絲狀真菌細胞壁的主要成分是多糖、蛋白質和脂類。文獻報道蝸牛酶、纖維素酶、溶壁酶這3種酶均可用于制備霉菌原生質體[8]，采用這3種酶制備C. liniST原生質體結果如表1所示。由表1可知，采用纖維素酶5mg/mL，蝸牛酶4mg/mL，溶菌酶1mg/mL的酶組合時原生質體的制備率最高，為1.19×108個/mL。另外，從表1還可以看出，在制備C. liniST原生質體時，溶菌酶的濃度對制備 率的影響非常小，而纖維素酶和蝸牛酶的濃度對制備率影響比較大，說明C. liniST的細胞壁主要是由纖維素和幾丁質構成，而由溶菌酶降解的葡聚糖含量相對較低。

表1 不同酶組合對菌株原生質體形成數量的影響

2.1.2 酶解時間對原生質體制備的影響

在制備原生質體的過程中，酶解時間過短或過長都會顯著影響原生質體的制備率。圖1顯示，C. liniST原生質體的制備率隨著酶解時間的延長而增加，2.5h時制備率達到最高，為2.14×108個/mL。這可能是因為酶解時間過短，菌體脫壁不完全，原生質體不能完全釋放，造成其制備率偏低；而酶解時間過長，酶解液中某些物質對早期釋放的原生質體細胞膜有破壞作用，加之原生質體細胞膜本身的不穩定性，最終導致原生質體制備率急速下降。因此，酶解時間以2.5h最為適宜。

2.1.3 酶解溫度對原生質體制備的影響

圖1 不同酶解時間對原生質體制備的影響

圖2 不同酶解溫度對原生質體制備的影響

不同的裂解酶在不同的溫度下其活性不同，進而影響原生質體的制備率。分別在30℃、32℃、 34℃、36℃制備C. liniST原生質體，結果如圖2 所示。由圖2可見，原生質體的制備率在32℃時達到最高，為2.22×108個/mL，而后隨著溫度的升高制備率降低。因此，后續實驗以32℃作為C. liniST原生質體最適酶解溫度。

2.2 原生質體的釋放

將裂解酶加入菌絲體酶解體系，經過酶解反應后，在顯微鏡下觀察原生質體的釋放過程。由圖3可知，隨著酶解時間的延長，菌絲體逐漸減少，原生質體的數量逐漸增多。當酶解0.5h時，反應液中存在大量完整未被破壞的菌絲體，而當酶解時間達到2.5h時，菌絲體幾乎完全裂解，并釋放出大量的原生質體。另外，從圖3(c)可看出，C. liniST原生質體多呈球形，中間一般含有一個液泡，其余的內含物呈月牙狀，透明性較液泡差。這與相關文獻報道的原生質體釋放過程相一致[9]。

2.3 原生質體的再生

圖3 C. lini ST原生質體釋放過程

圖4 不同培養基成分對原生質體再生的影響

適宜的培養基是保證原生質體進行再生重要因素之一。在C. liniST菌絲體固體培養基的基礎上， 添加適量的滲透壓穩定劑及營養因子，考察不同培養基對C. liniST原生質體再生率的影響。如圖4所示，在4種PDA培養基中，原生質體的再生能力基本一致，補加酵母膏的再生率略高，再生率為9.48%。與之相比，C. liniST原生質體在査氏高滲和FM高滲培養基的再生率較低，推測可能是PDA培養基中的土豆浸出液可作為細胞壁合成的前體物質，也可能通過代謝轉化成細胞壁的前體物質或起到促進代謝，加速細胞壁合成的作用。

2.4 原生質體等離子誘變

將C. liniST原生質體經ARTP照射不同時間后進行再生培養，根據再生單菌落計算其致死率，結果見圖5。隨著ARTP誘變時間的延長，原生質體致死率迅速增加。當照射時間為120s時，原生質體致死率達到95%左右。等離子誘變在致死率較高時比較易發生正向突變，故選擇120s作為原生質體的處理時間。

2.5 突變株的選育

圖5 不同誘變時間原生質體致死率

圖6 不同DHEA濃度原生質體的致死率

原生質體經ARTP誘變處理后，以DHEA的濃度為篩子進行抗性平板篩選，DHEA對原生質體的致死率如圖6所示。當DHEA的濃度為4g/L時， 致死率為32.8%；當DHEA濃度為12g/L時，致死率迅速增加到92.4%；當DHEA濃度為18g/L時，原生質體致死率已接近100%。由此可見，C. liniST原生質體的致死率在DHEA濃度為12～14g/L時易發生正向突變，選擇14g/L DHEA的平板進行陽性突變株的初篩。

從抗性平板的單菌落中挑取60株突變株，轉接于發酵培養基培養24h后，投入10g/L的DHEA轉化72h，測定各突變株的7α，15α-diOH-DHEA得率。如圖7所示，通過搖瓶轉化實驗驗證，最終獲得了6株產物得率有較大提高的菌株y-1、y-4、y-14、y-15、y-19和y-45。

2.6 突變株遺傳穩定性考察

將6株突變株分別進行傳代培養，以考察其遺傳穩定性。如圖8所示，經過連續5代的培養，得到了一株轉化率高且穩定的菌株，命名為C. liniST-0317。其在DHEA濃度為10g/L的條件下，經過多次傳代培養，7α,15α-diOH-DHEA的得率為36.5%～38.0%。

2.7 突菌株ST-0317底物耐受性

圖7 突變菌株篩選

圖8 突變株ST-0317的遺傳穩定性

圖9 出發菌株與優勢菌株菌體活性的比較

以出發菌株ST作為對照，考察ST-0317對不 同濃度DHEA的耐受性。由圖9可以看出，在DHEA濃度低于4g/L時，DHEA對菌體的毒害作用比較小，ST與ST-0317對底物的耐受性相差不大。但當DHEA濃度超過6g/L時，菌株ST-0317對DHEA的耐受性有顯著提高。當底物濃度高達18g/L時，菌株ST-0317仍能保持62.4%的催化活性，而菌株ST已低于20%。由此可見，突變株ST-0317對高濃度底物的耐受性顯著高于出發菌株ST。

2.8 突菌株ST-0317轉化過程分析

將出發菌株ST、突變株ST-0317分別在發酵培養基中培養24h后，投入10g/L的DHEA，測定轉化過程曲線，結果如圖10所示。在前24h，菌株ST和ST-0317的雙羥產物得率均比較低。隨著轉化時間的延長，出發菌株ST在72h時產物得率達到最高，為24.6%。而突變株ST-0317的轉化速率明顯高于出發菌株，在轉化60h后，7α,15α-diOH- DHEA的得率可達到36.9%，比ST提高了50%。同時，ST-0317的轉化周期也由72h縮短至60h。結果說明突變株ST-0317經等離子誘變后不但提高了對高濃度底物的耐受性，而且提高了其對DHEA的轉化率。

圖10 菌株ST和ST-0317的轉化過程曲線

3 結 論

以C. liniST作為出發菌株制備原生質體，確定了C. liniST原生質體制備及再生的最佳條件。原生質體經ARTP誘變后，獲得一株底物耐受性高且7α，15α-diOH-DHEA產量顯著提高的突變株ST-0317。對其轉化特性進行分析，在DHEA濃度為10g/L的條件下，ST-0317的7α,15α-diOH-DHEA得率為36.9%，比出發菌株提高50%，同時轉化周期由72h縮短至60h。

原生質體誘變技術在提高C. liniST底物耐受性及轉化率上取得了良好的效果，突菌株C. liniST-0317預期在經過發酵和轉化條件的優化后，其轉化能力會有更大幅度的提高。

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