新型醛酮還原酶不對稱轉化制備(S)-N,N-二甲基-3-羥基- 3-(2-噻吩)-1-丙胺

郭榮云，聶堯，穆曉清，徐巖，2，肖榮

（1江南大學生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2江南大學食品生物技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3羅格斯大學高級生物技術與醫學中心，新澤西州 08854，美國）

度洛西汀，化學名(S)-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)-1-丙胺，商品名為Cymbalta，是一種有效抑制5-羥色胺及去甲腎上腺素再攝取抑制劑（SNRI）。臨床上用其鹽酸鹽治療重癥抑郁癥、糖尿病性外周神經疼痛及女性應激性尿失禁。在與度洛西汀具有相同化學組成的兩種同分對映異構體中，只有(S)-構型具有抗抑郁的藥理活性[1]。目前，由于起始原料不同，不對稱合成手性度洛西汀的方法很多[2]。其中，(S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DHTP）是制備度洛西汀的重要手性中間體，因而通過(S)-專一性不對稱還原N,N-二甲基- 3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP）已成為高效制備度洛西汀的一種重要途徑。

微生物法還原羰基化合物以其高效、專一、反應條件溫和、立體選擇性好等優點，已成為制備手性醇的重要手段[3-4]。目前，已篩選得到多株能夠不對稱還原制備度洛西汀中間體的微生物，如Exiguobacteriumsp.[5]、Thermoanaerobactersp.[6]、Candida tropicalis[7]、C. viswanathii[8]等。其中C. tropicalis、C. viswanathii能夠全細胞催化DKTP還原生成(S)-DHTP，并獲得＞80%的轉化率和高對映體過量值(＞99%)，但反應底物濃度仍較低，反應效率仍較為有限[7-8]。這可能是由于其細胞或胞內功能酶的性質局限性以及全細胞的細胞膜結構阻礙底物（DKTP）與酶的相互作用，從而影響時空產率[9]，進而大大限制了其工業應用。而且，目前國內度洛西汀手性中間體的研究較少，且水平較低[10]。因此，有必要開發新型高選擇性的還原酶及其不對稱催化轉化的反應體系，以實現(S)- DHTP的高效生物反應制備。

近年來，直接利用已有的數據庫進行新型催化劑的開發已逐漸發展成為一種實現生物轉化的有效手段[11-12]。在微生物催化立體選擇性氧化還原反應的研究中，C. parapsilosis表現出顯著的催化特性，是比較突出的立體選擇性氧化還原酶酶源[13]，如醛酮還原酶[14]、中鏈脫氫酶[15-16]、短鏈脫氫酶[15]。目前，C. parapsilosis中用于不對稱轉化的醛酮還原酶的開發應用比較有限[17]，因此有必要進一步挖掘新型的醛酮還原酶用于催化DKTP的不對稱轉化。本研究利用C. parapsilosis的基因組信息，從C. parapsilosisCCTCCM-203011中得到8個新型的醛酮還原酶，重組表達后，用其構建粗酶反應體系，催化還原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP）生成(S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DHTP），見圖1。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Candida parapsilosis CCTCCM 203011菌株來自本實驗室收藏，Escherichia colistrain XL-10 Gold、E. coliBL21 (DE3) 、pET21c質粒購于美國Novagen公司，基因操作試劑均購自大連寶生物有限公司。

圖1 粗酶體系催化還原DKTP生成 (S)-DHTP

N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP）、(S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DHTP）均購自浙江九洲藥業股份有限公司；氨芐青霉素、 IPTG均購自上海生工生物技術有限公司；輔酶NADPH、NADP+均購自上海索萊寶生物科技有限公司；正己烷（色譜純）、異丙醇（色譜純）均購自Tedia公司；其他分析純試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌株的構建和菌體培養

使用在線分析軟件NCBI（http：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）利用C. parapsilosis基因組數據庫（http：//www.sanger.ac.uk/sequencing/Candida/ parapsilosis/）在C. parapsilosisCCTCC M203011中挖掘得到8個同源醛酮還原酶序列，見表1[18-19]。設計引物（表1）擴增獲得醛酮還原酶編碼區基因，構建重組質粒pET21c，將重組質粒轉化到E.coliBL21 (DE3) 感受態細胞中進行活性表達。

重組大腸桿菌在含50μg/mL氨芐青霉素的LB 培養基中于37℃、200r/min 振蕩培養至OD600達到0.6～0.8，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，于17℃、200r/min 誘導表達12h。

1.2.2 粗酶液的制備

將誘導表達后的發酵液于8000r/min離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌3次，重懸于0.1mol/L磷酸鉀緩沖液（pH=6.5）中（細胞濃度為100g/L），超聲波破碎細胞。破碎條件：工作時間1s，間隔時間3s，總工作時間5min。4℃的條件下12000r/min 離心15min，收集上清液作為粗酶液用于不對稱催化反應。

1.2.3 酶促不對稱還原DKTP合成 (S)-DHTP

2mL磷酸鉀緩沖液（0.1mol/L，pH=6.5）中含有1mL粗酶液（總蛋白含量5mg）及5g/L DKTP、輔助底物糖（醇）（10g/L）、NADPH（0.1mmol/L）和NADP+（0.1mmol/L），置于30℃、200r/min的搖床中L反應24h。反應結束后，加入2倍體積乙酸乙酯萃取，有機相用高效液相色譜儀分析產物光學純度及產率。本文中的生物轉化試驗均重復3次，然后取其平均值。

1.2.4 產物DHTP的分析

產物分析在Agilent 1200型液相色譜儀上進行，色譜柱為Chiralcel OD-H柱 (4.6mm × 25cm；日本Daicel Chemical公司)，流動相為正己烷∶異丙醇（8∶2，體積比），流速為0.6mL/min，檢測波長為241nm。(R)-DHTP及(S)-DHTP的保留時間分別為15.48min、16.78min，底物DKTP的保留時間為28.27min。

轉化率（X）和產物ee值的計算公式如式（1）、式（2）。

表1 基于基因組數據庫挖掘得到的潛在醛酮還原酶基因及其引物序列

式中，Co為底物的初始濃度；CP為反應終止時產物的濃度；CS、CR分別為 (S)-DHTP、(R)-DHTP 的濃度。

1.2.5 催化反應條件的優化

在1.2.3節的不對稱反應條件下，在1g/L DKTP時，考察8個醛酮還原酶重組菌不對稱還原 DKTP 的能力，篩選出能夠高立體選擇性催化還原生成光學活性 (S)-DHTP 的優良菌株。在此基礎上，在5g/L DKTP時考察了輔底物、輔酶濃度、反應溫度、反應初始pH值、底物濃度對重組大腸桿菌粗酶液反應體系不對稱還原DKTP生成光學活性(S)-DHTP的影響，旨在優化催化反應條件。

2 結果與討論

2.1 不對稱還原DKTP的新型醛酮還原酶的基因組挖掘

利用C. parapsilosis的基因組信息，通過與conjugated polyketone reductase C1的序列相似性挖掘得到8個醛酮還原酶（CPARs）基因核苷酸編碼序列，這些序列編碼蛋白的一級結構與conjugated polyketone reductase C1具有15%～42%的同源性，說明通過基因組挖掘得到的讀碼框序列編碼新型的潛在醛酮還原酶。利用重組大腸桿菌分別表達8種潛在醛酮還原酶編碼基因，構建了醛酮還原酶工具箱。這8株重組大腸桿菌經細胞培養、細胞破碎后，進行粗酶催化反應，篩選能夠高立體選擇性不對稱還原 DKTP 生成光學活性的 (S)-DKTP的醛酮還原酶，結果見表2。酶促不對稱還原DKTP發現，CPARs 均為NADPH依賴型（結果未顯示），CPAR4在DKTP 1g/L時，產物ee值大于99%，產率達到 95.2%，具有不對稱還原DKTP生成 (S)-DHTP的立體專一性。

表2 不同醛酮還原酶催化還原 DKTP 的特性對比

2.2 粗酶體系催化還原DKTP生成(S)-DHTP的 研究

目前，醛酮還原酶不對稱催化還原羰基化合物的主要反應類型為全細胞、純酶、粗酶催化。其中，全細胞催化因能利用細胞自生的輔酶代謝途徑進行輔酶再生而備受關注，但全細胞的細胞膜結構阻礙底物（DKTP）與酶的相互作用，從而影響其時空產率[9]，進而大大限制了其工業應用；純酶催化因具有較高的反應速率和較少的副反應而優勢明顯，但酶純化及輔酶添加（或建立輔酶再生體系）會大大提高反應成本；粗酶催化因含有細胞內部全部的酶，能夠利用其中自有的酶系統構建自組裝的輔酶循環系統，解決細胞膜對底物（DKTP）的屏障及輔酶循環問題。因此，本研究采用CPAR4粗酶液構建粗酶體系催化還原DKTP生成(S)-DHTP的 研究。

2.2.1 輔助底物對粗酶體系轉化反應的影響

由于醛酮還原酶在催化立體選擇性氧化還原反應過程中，需要輔助底物作輔酶循環系統的供氫體，因此，有必要研究輔助底物對反應的影響。因此本研究選擇多種糖類（蔗糖、葡萄糖、木糖、麥芽糖、果糖、乳糖）和醇類（甘油、乙醇、異丙醇、山梨醇）作為輔助底物進行研究，考察其對轉化作用的影響，結果如表3所示。實驗結果顯示，多種糖類及醇類能夠作為此自組裝輔酶循環系統的輔助底物。其中糖類中效果最好的是果糖和乳糖，在四種醇類中效果最好的是乙醇和異丙醇。多種糖類及醇類對反應的促進作用暗示了粗酶體系中存在多種可以用作輔酶循環的酶類。由于乳糖可被細胞粗酶液中的水解酶類水解為半乳糖和葡萄糖，其在粗酶液中的代謝過程伴隨著輔酶的產生，這可能解釋乳糖對反應具有最佳的促進作用。雖然乙醇、異丙醇對催化反應也具有較佳的促進作用，但其促進作用仍低于乳糖，且醇類化合物的極性大對生物催化劑易產生抑制作用[20]。綜合考慮，本研究選擇乳糖作為輔助底物進行下一步研究。

表3 輔助底物對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

2.2.2 輔酶濃度對粗酶體系轉化反應的影響

TTN（total turnover number，TTN）指每摩爾輔酶所能生成的目的產物的摩爾數，是衡量輔酶利用效率的一個重要指標，以及評價輔酶再生方法是否具備良好再生能力和應用前景的一個重要指標。因此，本研究考察了輔酶NADPH和NADP+濃度對反應的影響，如表4所示。結果顯示NADP+和NADPH濃度對反應影響基本一致，由于氧化型輔酶NADP+的價格低于還原性輔酶NADPH的價格，NADP+作為輔酶用于反應是一個更為經濟的選擇。在底物濃度為5g/L，NADP+濃度為0.01mmol/L時，反應的TTN可達883，但其產率僅有32.4，當NADP+濃度為0.02mmol/L時，反應的TTN為852，產率為62.5%。在兼顧產率及TTN的情況下，NADP+濃度為0.02mmol/L是最適輔酶濃度。

2.2.3 反應溫度對粗酶體系轉化反應的影響

由于粗酶體系中細胞內部的酶類失去了細胞膜 的保護，對溫度非常敏感。因此有必要研究溫度對粗酶催化的不對稱反應的影響，如圖2所示。研究結果表明，反應的溫度對產物的產率和光學純度都有一定的影響，在溫度低于30℃時，隨著溫度的升高，產物產率逐漸增大，產物的光學純度保持在99%以上；而當反應溫度高于30℃時，隨著溫度的升高，產物產率和光學純度都減小，一方面由于高溫使酶失活，產率減小；另一方面當反應溫度超過30℃時，可能由于酶立體選擇性的改變導致產物光學純度降低。因此，30℃為反應最適溫度，產物ee值為99%，產物產率可達70.9%。

表4 輔酶濃度對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

圖2 溫度對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

2.2.4 反應pH值對粗酶體系轉化反應的影響

在生物催化的反應過程中，反應體系的pH值不僅會影響酶的構型、穩定性以及活性中心的解離狀態，還會影響輔酶體系和反應中氫傳遞及電子轉移。生物催化體系pH值對DKTP的不對稱還原效率的影響如圖3所示。研究結果表明，初始pH值小于6時，CPAR4的產率及光學純度受影響較大，隨著pH值的升高，產物產率及光學純度逐漸增大；而pH值大于6時，CPAR4的產率及光學純度受影響較小。因此，pH=6.5為反應最適pH值。

2.2.5 底物濃度對粗酶體系轉化反應的影響

圖3 pH值對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

圖 4 底物濃度對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

對于傳統的化學催化劑來說，生物催化劑的主 要劣勢在于較低的底物耐受性。底物濃度對不對稱還原反應催化的影響如圖4所示，在底物濃度小于3g/L時，隨著底物濃度的升高，產率略有下降；當底物濃度為3g/L時，產率依然達到94.5%。繼續提高底物濃度時，產率有一定的下降。當底物濃度為5g/L 時，產率達到71.2%，且底物濃度進一步增加至6g/L時，產率仍有50%左右。說明底物DKTP本身對粗酶體系有較大影響，且該酶體系對高濃度的DKTP具有一定的耐受性。

3 結 論

本研究利用C. parapsilosis的基因組信息，挖掘得到8個新型的醛酮還原酶（CPARs）基因，構建醛酮還原酶工具箱（重組大腸桿菌分別表達8 種醛酮還原酶）。在構建的8株重組菌中，CPAR4能夠高立體選擇性地不對稱還原DKTP得到 (S)-DHTP。為進一步提高底物DKTP的轉化率、構建CPAR4的粗酶催化反應體系，此反應體系需要乳糖作為輔助底物以及極少量NADP+作為起始輔酶。通過此粗酶反應體系的優化，3g/L的DKTP產率達到94.5%，光學純度大于99.9%，這與目前報道的最高水平相當[21]。研究結果進一步證明，基于基因組信息挖掘，可以有效獲得用于制藥和精細化工行業的新型高效生物催化劑。此外， 針對生物催化不對稱氧化還原反應的傳質、電子傳遞等問題，建立具有自身輔酶再生能力的粗酶催化體系具有一定的應用潛力。

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