PPARγ C161→T、α-內收蛋白Gly460Trp基因多態性 與原發性高血壓的關系

張揚，鄒曉譯，劉雙江，孫強，丁麗君，郝佳，趙君

論著·臨床

PPARγ C161→T、α-內收蛋白Gly460Trp基因多態性 與原發性高血壓的關系

張揚，鄒曉譯，劉雙江，孫強，丁麗君，郝佳，趙君

目的探討過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)C161→T及α-內收蛋白Gly460Trp基因多態性與原發性高血壓(EH)的關系。方法原發性高血壓患者(高血壓組)262例與正常人群270例(健康對照組)為研究對象，應用聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態性方法對PPARγ基因及α-內收蛋白Gly460Trp基因多態性位點進行分析，統計2種基因多態性頻率并進行比較。結果高血壓組PPARγ C161→T基因型分布情況為TT型10例(3.82%)，TC型70例(26.72%)，CC型182例(69.46%)，T型等位基因為90例次(17.18%)，C型等位基因為434例次(82.82%)；健康對照組PPARγ C161→T基因型分布情況為TT型17例(6.30%)，TC型119例(44.07%)，CC型134例(49.63%)，T型等位基因為153例次(28.33%)，C型等位基因為387例次(71.67%)，2組間分布比較差異有統計學意義(P<0.05)。高血壓組α-內收蛋白Gly460Trp基因型分布情況為GlyGly型57例(21.76%)，GlyTrp型為129例(49.23%)，TrpTrp型為76例(29.01%)，Gly型等位基因為243例次(46.37%)，Trp型等位基因為281例次(53.63%)；健康對照組α-內收蛋白Gly460Trp基因型分布情況為GlyGly型63例(23.33%)，GlyTrp型為124例(45.93%)，TrpTrp型為83例(30.74%)，Gly型等位基因為250例次(46.30%)，Trp型等位基因為290例次(53.70%)，2組間分布比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論中國人群中PPARγ C161→T基因多態性與原發性高血壓病相關；α-內收蛋白Gly460Trp基因多態性與原發性高血壓無相關性。

高血壓，原發性；過氧化物酶體增殖物活化受體γ；α-內收蛋白；基因多態性

原發性高血壓(EH)是遺傳因素及環境因素綜合作用引起的多基因遺傳病，相關基因研究成為近年來關于EH研究的熱點及重點。有研究發現高血壓大鼠血壓升高與內收蛋白有關，內收蛋白在調節跨膜離子轉運與鈉鉀泵功能等方面起重要作用[1]；但不同人群研究得出的結論不一致；同時有研究表明活化的過氧化物酶體增殖物活化受體(PPAR) 可產生多種生物學效應，涉及的相關疾病有糖尿病、高脂血癥、代謝綜合征等，在血管病變中亦發揮作用[2]；而有關PPARγ C161→T基因多態性與原發性高血壓的研究鮮有報道。本研究采用聚合酶鏈反應等方法同時探討PPARγ C161→T、α-內收蛋白Gly460Trp基因多態性與原發性高血壓的關系[3]。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2003年6月—2004年11月我院心內科診治原發性高血壓患者262例(高血壓組)，均符合1999年WHO/ISH指南的標準：(1)有明確高血壓史且已服用抗高血壓藥物者；(2)未服用抗高血壓藥物，非同日2次收縮壓≥140 mm Hg和/或舒張壓≥90 mm Hg，排除繼發性高血壓、糖尿病、冠心病及嚴重肝腎功能障礙病史者。262例中男109例，女153例；年齡53～75歲；病程3～12年；有家族史48例，吸煙史86例；選擇本院同期健康體檢者270例為健康對照組，男116例，女154例；年齡53～74歲；有吸煙史76例；排除高血壓、糖尿病、冠心病及肝腎功能障礙病史者。全部入選各受試者間無親緣關系，均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器： PCR引物(上海英駿生物公司、上海生物工程技術服務有限公司合成),dNTPs、100 bp DNA marker、Taq plus DNA聚合酶、Promega瓊脂糖、聚丙烯酰胺(北京鼎國生物公司)，限制性內切酶BbrpI(日本東洋紡公司)、Sau96 I(北京紐英倫生物技術有限公司)，GRADIENT基因擴增儀(Biometra公司)，Tanon Gis-1000凝膠成像系統(上海天能生物公司)。

1.2.2 基因多態性測定： 2組對象均采集外周空腹肘靜脈血2 ml，注入含有EDTA的真空抗凝管中，緩慢搖勻，采用傳統酚/氯仿法提取基因組DNA。

1.2.2.1 PPARγ基因多態性測定 (1)目的片斷擴增：以基因組DNA作為模板進行PCR擴增，上游引物：5′-CAAGACAACCTGCTACAAGC-3′；下游引物：5′-TCCTTGTAGATCTCCTGCAG-3′。PCR反應體系25 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，上游引物和下游引物各0.5 μl，dNTPs(10 mmol/L) 0.5 μl，基因組DNA 0.2 μg，Taq plus DNA聚合酶0.8 U。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35個循環；72 ℃ 7 min。(2)PCR產物經限制性內切酶BbrpI酶切：20 μl酶切體系中，PCR產物7 μl，BbrpI 2 U，經37 ℃消化16 h。(3)電泳分離酶切產物：消化產物經質量分數2%瓊脂糖凝膠電泳分離，由北京鼎國生物公司提供SSR DNA ladder作為DNA片段大小的標準物，于60 V恒壓下電泳45 min，在紫外燈下可見3種不同片段大小的組合(見圖1)。PPARγ基因6號外顯子全長249 bp，其中第159～164位基因序列依次為CACGTG，是限制性內切酶BbrpI的酶切位點。如果第161位的C堿基突變為T堿基，則限制性內切酶BbrpI不能識別并酶切該位點，從而形成了限制性片斷長度的多態性。如果第161位的是C堿基，該基因型稱為CC型；若為T堿基，該基因型稱為CT型或者TT型(即雙鏈的2個基因拷貝均發生該位點突變)。PPARγ出現3種基因型：TT型200 bp；TC型200、120、80 bp；CC型120、80 bp。

圖1 PPARγ基因片段電泳結果

1.2.2.2 α-內收蛋白Gly460Trp基因多態性測定 (1)目的片斷擴增：上游引物：5′-CTCCTTTGCTAGTGACGGTGATTC-3′；下游引物：5′-GACTTGGCACTGCTTCCATTCGGC-3′。PCR反應體系20 μl，10×PCR buffer 2 μl，上游引物和下游引物各0.5 μl，基因組DNA 1 μl， RedTaq plus DNA聚合酶1 μl，dNTPs 0.5 μl。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35個循環；72 ℃ 5 min。(2)PCR產物經限制性內切酶Sau96 I酶切：20 μl酶切體系中，PCR產物10 μl，Sau96 I 0.5 μl，經37 ℃消化16 h。(3)電泳分離酶切產物：消化產物經質量分數12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，后用硝酸銀染色，經凝膠成像系統觀察電泳圖(見圖2，其中GT和GG基因型的25 bp條帶溢出膠外)。PCR擴增產物片段全長147 bp，經限制性內切酶Sau96 I識別并酶切產生3種酶切產物，從而形成了限制性片斷長度的多態性。人類α-內收蛋白基因含17個外顯子和16個內含子，第10外顯子存在G614T位點突變，致編碼該蛋白的460位甘氨酸(Gly)被色氨酸(Try)代替。野生純合子GlyGly型為122，25bp；雜合子GlyTrp型為147，122，25bp；突變純合子型TrpTrp型為147bp。

圖2 Gly460Trp基因蛋白電泳結果

1.3 觀測項目 記錄受試者性別、年齡、體質量指數(BMI)、家族史、吸煙史、病程，同時測定其總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

2 結 果

2.1 臨床資料比較 2組除血壓外，性別、年齡、BMI、吸煙史比例、TG、TC、HDL-C、LDL-C比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組臨床資料比較

2.2 PPARγ、α-內收蛋白基因型頻率及等位基因頻率比較 2組間PPARγ基因型分布頻率及等位基因分布差異有統計學意義(P<0.05)，α-內收蛋白基因型分布頻率及等位基因差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、3。

表2 2組PPARγ基因型頻率及等位基因頻率比較 [例(%)]

注：與健康對照組比較，*P<0.05

表3 2組α-內收蛋白基因型頻率及等位基因頻率比較 [例(%)]

3 討 論

PPARγ主要存在于脂肪組織，并呈高表達，在脂肪細胞分化中扮演重要角色[2]，在免疫系統、肝臟、骨骼肌、心臟血管平滑肌細胞、內皮細胞、視網膜等組織細胞中呈低水平表達。PPARγ經配體激活后參與體內多種生理和病理過程，影響疾病發生、發展及預后。PPARγ激活后介導的生物效應主要包括脂類代謝、糖類代謝、炎性反應、免疫反應與細胞分化、凝血異常、內皮損傷等[4～6]。目前已發現PPARγ基因的多個突變位點，且突變基因之間的交互和對血壓水平產生重大影響[4]。國內研究發現PPARγ C681G基因多態性與漢族人群中高血壓病的發生有關[5]。國外研究發現PPARγ基因多態性與腎素水平有關，提示其基因多態性與高血壓發病有關[7]。國內研究結果發現PPARγC161→T變異能減少頸動脈粥樣硬化損害[8]。本研究結果顯示，高血壓組突變雜合子TC基因型和純合突變TT基因型明顯低于健康對照組，且2組等位基因分布頻率差異有統計學意義。PPARγC161→T變異可能通過多個機制發揮其降壓作用。約50%原發性高血壓患者存在不同程度的胰島素抵抗，新型抗糖尿病藥物噻唑烷酮類(TZDs)作為PPARγ的合成配體，通過激活PPARγ，減輕胰島素抵抗并增強胰島素敏感性，發揮其降壓作用；同時，TZDs還可刺激血管內皮細胞分泌C型鈉尿肽，以自分泌或旁分泌方式作用于血管平滑肌，發揮其直接血管舒張作用；TZDs還能明顯抑制內皮素-1分泌及過氧化氫等氧自由基生成，影響動脈彈性功能和結構。激活的PPARγ還可抑制單核—巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6和組織因子及血小板活化因子受體、血管細胞黏附分子1表達，限制慢性炎性反應，維持細胞膜通透性穩定，抑制平滑肌細胞興奮—收縮耦聯活性，減少平滑肌細胞的鈣流入和鈣敏感性，從而抑制血管收縮反應、平滑肌細胞增生與肥大、降低血管阻力，進而有效抑制壓力負荷增加。研究結果表明，激活的PPARγ可通過蛋白質—蛋白質之間的相互作用抑制Sp1，從而在轉錄水平上抑制血管緊張素-II的1型受體(AT1R)，而血管緊張素-II作為腎素—血管緊張素—醛固酮系統的主要效應物質，是通過AT1R參與高血壓發病與維持。因此，PPARγ C161→T變異通過上述機制更好地發揮降壓作用。PPARγ C161→T基因多態性與原發性高血壓病相關，該變異能降低個體罹患高血壓的危險性，對此基因結構和功能調控的深入研究，將有利于進一步揭示高血壓病的發病機制。

α-內收蛋白是一細胞膜骨架蛋白，多種細胞中均有α-內收蛋白存在，有諸多功能位點，參與細胞信號轉導及細胞膜離子轉運，與Na+的轉運機制關系尤為密切[9]。國內外有研究探討高血壓與α-內收蛋白基因Gly460Trp多態性，但結論不一。多數研究關注鹽平衡領域及神經內分泌調節領域。納入10 960例中國人群的薈萃分析提示，中國人口混合民族α-adducin Gly460Trp基因多態性與EH易感性,漢族最強烈[10]。研究顯示俄羅斯人口Gly460Trp基因的多態性是EH易感性基因,但其病理效應完全體現在環境因素的影響[11]。Ramu等[12]發現在南印度Tamilian人口Gly460Trp多態性不是原發性高血壓的危險因素。Sciarrone等[13]研究發現，不同的EH患者中460Trp等位基因攜帶者血漿腎素水平不同，應用噻嗪類利尿劑降壓治療后，Trp460Trp基因型患者血壓降低幅度更顯著。考慮與該基因型患者腎臟鈉鹽調控機制受損，細胞內鈉代謝和機體鹽敏感性改變有關。本試驗未發現α-內收蛋白基因Gly460Trp多態性與EH的相關性。分析結論產生分歧的原因：(1)不同種族基因型分布頻率不同，存在種族差異；(2)生存環境、生活方式不同，即人群的基本特征不同，如我國南方人群及西方人群鹽攝取量較我國北方人群鹽攝取量明顯為少，存在很多差異；(3)研究方法、統計方式及樣本納入研究對象的數量不同等導致研究結果產生分歧和差異。

原發性高血壓的病因為多因素，通常認為是高血壓遺傳易感性和環境因素相互作用的結果，二者比例約為2∶3。對于諸多基因結構和功能調控的深入研究，將有利于進一步揭示高血壓病的發病機制。同時高血壓的病程較長，進展一般較緩慢，上述數種基因在高血壓病始動、維持和加速等不同階段的作用機制有待于進一步探討。此外,大型和嚴格的病例對照研究,探討基因—基因—環境交互可能產生更多的結論性的關于高血壓的分子遺傳學認識。

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TherelationshipbetweenthepolymorphismofPPARγC161→T,α-adducinGly460Trpandessentialhypertension

ZHANGYang*,ZOUXiaoyi,LIUShuangjiang,SUNQiang,DINGLijun,HAOJia,ZHAOJun.

*DepartmentofCardiology,theFirstHospitalofQinhuangdao,HebeiProvince,Qinghuangdao066000,China

ObjectiveTo investigate the relationship between peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ) C161 → T, α-adducin gene Gly460Trp polymorphism and essential hypertension (EH).MethodsPatients with essential hypertension (hypertension group) were 262 cases, and 270 normal persons (control group) were enrolled in the research, using polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism of loci PPARγ gene and α-adducin gene Gly460Trp analysis, analyzed the 2 kinds of gene polymorphism frequency and compared between them.ResultsIn hypertension group, PPARγ C161 → T genotype distribution as follows：10 cases of type TT (3.82%), type TC in 70 cases (26.72%), type CC in 182 cases (69.46%), the T allele was 90 cases (17.18%), C allele was 434 cases (82.82%); In healthy control group, distribution of PPARγ C161 → T gene type were TT type in 17 cases (6.30%), type TC in 119 cases (44.07%), type CC in 134 cases (49.63%), the T allele was 153 cases (28.33%), C allele in 387 cases time (71.67%), compared the difference of distribution between the 2 groups showed statistically significant (P<0.05). Hypertension group alpha-adducin Gly460Trp genotype distribution as follows：GlyGly type in 57 cases (21.76%), type GlyTrp in 129 cases (49.23%), type TrpTrp in 76 cases (29.01%), the Gly allele was 243 cases (46.37%), the Trp allele was 281 cases (53.63%); healthy controls' α-adducin Gly460Trp genotype distribution as follows：GlyGly type in 63 cases (23.33%), type GlyTrp in 124 cases (45.93%), type TrpTrp in 83 cases (30.74%), the Gly allele was 250 cases (46.30%), the Trp allele was 290 cases (53.70%), no statistically significant difference of distribution between the 2 groups were found (P>0.05).ConclusionChinese population with PPARγ C161→T gene polymorphism correlated with essential hypertension; no correlation between α-adducin gene Gly460Trp polymorphism and essential hypertension.

Hypertension,essential; Peroxisome proliferator activated receptor gamma; α-adducin; Gene polymorphis

066000 秦皇島市第一醫院心內科(張揚、鄒曉譯、孫強、丁麗君、郝佳、趙君)，急診科(劉雙江)

10.3969/j.issn.1671-6450.2014.06.006

2014-02-24)