復方枇杷桔梗膏質量標準研究

謝周濤，胡 進

（湖北省新華醫院藥學部，湖北 武漢 430015）

復方枇杷桔梗膏由枇杷葉、罌粟殼、桔梗、薄荷腦等9味中藥組方，具有養陰斂肺、祛痰鎮咳的功效，用于久咳勞嗽、上呼吸道炎、支氣管炎引起的咳喘痰飲等癥。罌粟殼為方中主藥，嗎啡為其主要成分之一[1－3]，但具有成癮性，必須控制其含量。為控制該制劑質量，保證臨床療效，本試驗中采用薄層色譜（TLC）法對方中枇杷葉、罌粟殼、桔梗、薄荷腦進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中嗎啡的含量。現報道如下。

1 儀器與試藥

戴安summit P680型高效液相色譜儀，summit P680A型低壓四元泵，PDA100型二極管陣列檢測器，ASI100型自動進樣器，summit柱溫箱，Chromeleon色譜工作站，UV－3300型掃描型紫外／可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）。固相小柱（十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充，填充物250 mg，容積6 mL，天津市琛航科技儀器有限公司）；AB－265s型梅特勒（十萬分之一）分析天平。嗎啡對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號為171201－200419）；枇杷葉對照藥材（批號為 121261－0301）；罌粟殼對照藥材（批號為110722－200309）；桔梗對照藥材（批號為121028－200907）；薄荷腦（批號為 0728－200005）；復方枇杷桔梗膏（本醫院制劑，批號分別為 100921，100922，100923，100931，100932，100933）；乙腈（色譜純，天津康巢正興科技有限公司），水為雙重蒸餾水，磷酸二氫鉀、庚烷磺酸鈉（分析純，天津大茂化學試劑廠），其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

枇杷葉：取樣品10 g，加水40 mL，攪勻，用乙醚振搖萃取3次，每次40 mL，乙醚層備用；合并水層，加0.5 g氫氧化鈉使溶解，搖勻，水層溶液加水飽和的正丁醇提取4次，每次30 mL；合并正丁醇液，水洗至中性，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取枇杷葉對照藥材 1 g，加水 100 mL，煎煮 30 min，濾過，濾液加氫氧化鈉配成1%的濃度，濾液按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。取缺枇杷葉的陰性樣品，同法制得陰性對照品溶液。照TLC法[2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一以0.4%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以氯仿－醋酸乙酯－甲醇－水（16 ∶38 ∶22 ∶9）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 5% 磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色斑點，陰性對照品溶液無干擾(見圖1A)。

罌粟殼：取樣品15 g，加氨試液調pH至10，用三氯甲烷萃取3次，每次30 mL，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取罌粟殼對照藥材1.5 g，加水30 mL煎煮30 min，濾過，取濾液，同法制成對照藥材溶液。取缺罌粟殼的陰性樣品，同法制得陰性對照品溶液。照TLC法[2010年版《中國藥典（一部）》附錄Ⅵ B]試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一以0.4%羧甲基纖維素鈉為黏合劑含2%氫氧化鈉制備成的硅膠G薄層板上，以甲苯－丙酮 －乙醇－濃氨試液（20∶19∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀溶液。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液無干擾(見圖1B)。

桔梗：取樣品15 g，加水40 mL，攪勻，用乙醚振搖萃取3次，每次40 mL，合并水層，用鹽酸試液調節 pH至3，再用乙酸乙酯萃取2次，每次40 mL，分取乙酸乙酯層，合并，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取桔梗對照藥材3 g，碾細，加水，超聲提取30 min，離心，過濾，取濾液濃縮成浸膏，取2 mL浸膏，同法制成桔梗對照藥材溶液。另取桔梗陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。照TLC法[2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一用0.3%氫氧化鈉調制的硅膠薄層板上，以正己烷－氯仿－甲醇（15∶11∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴25%磷鉬酸乙醇溶液后105℃顯色，供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色斑點，陰性對照品無干擾(見圖1C)。

薄荷腦：取枇杷葉項下的乙醚提取液，揮干乙醚，殘渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取薄荷腦對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含0.5 mg薄荷腦的溶液，作為對照品溶液。取缺薄荷腦的陰性樣品，同法制得陰性對照品溶液。照TLC法[2010年版《中國藥典（一部）》附錄Ⅵ B]試驗，吸取上述 3種溶液各10 μL，分別點于同一以0.4%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯（9∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，熱風吹至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液無干擾(見圖1D)。

圖1 薄層色譜圖

2.2 嗎啡含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol／L 磷酸二氫鉀水溶液 －0.002 5 mol／L 庚烷磺酸鈉水溶液 －乙腈（44 ∶44 ∶12）；檢測波長：220 nm；柱溫：25 ℃。理論板數按嗎啡峰計算應不低于1 000。

2.2.2 溶液配制

精密稱取在105℃干燥1 h的嗎啡對照品適量，加30%甲醇和5%醋酸溶液制成每l mL含無水嗎啡10 μg的溶液，作為對照品溶液。取以十八烷基鍵合硅膠為填充劑的固相小柱1支，依次用甲醇 －水（3∶1）混合溶液 15 mL及水 5 mL沖洗，再用 pH為9的氨試液50 mL沖洗備用。取本品20 g，精密稱定，置50 mL棕色瓶中，加5%醋酸溶液約25 mL，超聲10 min后加5%醋酸溶液至刻度，搖勻，離心10 min；精密移取離心上清液2 mL，置上述固相小柱上，加氨試液5 mL，待溶液滴盡后用水20 mL沖洗，再用5%醋酸溶液洗脫，用5 mL量瓶收集洗脫液至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

陰性干擾試驗：取陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制得陰性對照品溶液。在選定的色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖。結果表明，陰性對照品溶液色譜在與嗎啡對照品溶液色譜峰相應位置未檢測出色譜峰，表明處方中其他藥物對嗎啡的測定無干擾，該方法有較好的專屬性。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

線性關系考察：精密稱取嗎啡對照品10.23 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。精密量取上述貯備液 5 mL，分別置 10，25，50，100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度分別為 102.30，40.92，20.46，10.23 μg ／mL 的對照品溶液，再分別精密量取上述質量濃度為 10.23 μg／mL 的對照品溶液 5 mL，置 10，25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度分別為 5.115，2.046 μg ／mL的對照品溶液。在選訂的色譜條件下分別進樣10 μL，記錄各色譜峰峰面積，以峰面積（Y）均值為縱坐標、進樣量（X）為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為 Y＝126.414 6 X－1.317 1，r＝0.999 7（n＝6）。結果表明，嗎啡進樣量在 0.020 4～1.023 μg之間與峰面積具有良好線性關系。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液10 μL，重復進樣6次，測定峰面積。結果峰面積平均值為 13.584 3，RSD ＝1.16% （n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批號（100921）的樣品6份，依法制備供試品溶液并分別測定。結果嗎啡平均含量為 74.54 μg／g，RSD＝1.66% （n＝6），表明該方法重現性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，于 0，1，2，4，6，8 h 時分別進樣 10 μL測定。結果嗎啡峰面積平均值為13.765 2，RSD＝1.34%（n＝6），表明嗎啡溶液在 8 h時內基本穩定。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批樣品(批號為100921，嗎啡含量為 74.54 μg／g）6 份，各約 10 g，精密稱定。另取嗎啡對照品適量，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加5%醋酸溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。分別精密移取對照品溶液，置上述供試品溶液中，照供試品溶液的制備方法操作，分別進樣測定。結果見表1。

表1 嗎啡加樣回收試驗結果(n＝6)

2.2.4 樣品含量測定

取本品6批樣品，依法制備供試品溶液并測定嗎啡含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

3 討論

取嗎啡對照品溶液，置紫外分光光度儀于200～400 nm波長范圍內掃描，結果嗎啡在220.7 nm波長處有最大吸收，與2010年版《中國藥典（一部）》罌粟殼含量測定波長相近，故選擇220 nm為測定波長。

曾選用 0.5% 乙酸氨 － 甲醇（9 ∶1）、0.01 mol／L 磷酸氫二鉀溶液 －0.005 mol／L 庚烷磺酸鈉水溶液 －乙腈（40 ∶40 ∶20）、0.05 mol／L 磷酸二氫鉀溶液 －0.002 5 mol／L 庚烷磺酸鈉水溶液 －乙腈（42 ∶42 ∶16；44 ∶44 ∶12）作流動相，分別進樣測定，結果用 0.05 mol／L磷酸二氫鉀溶液 －0.002 5 mol／L庚烷磺酸鈉水溶液 －乙腈（44∶44∶12）為流動相分離效果較理想[4]，供試品溶液色譜中嗎啡能與其他組分達到基線分離，測得嗎啡峰面積最大。

對液液萃取法和固相小柱萃取法進行比較，后者制備樣品中嗎啡的含量高于前者。中藥膏劑含糖量較高、粘度大，且固相小柱萃取效果好、方法簡便，故本試驗選擇固相小柱萃取法作為供試品溶液的制備方法[5]。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：283.

[2]鄭宏鈞.現代中藥材鑒定手冊[M].第11版.北京：中國醫藥科技出版社，2001：489.

[3]苗明三，李振國.現代實用中藥質量控制技術[M].北京：人民衛生出版社，2000：1 090.

[4]康小玉，錢思明.RP－HPLC測定洋參保肺糖漿中嗎啡的含量[J].中成藥，2000，22（11）：762 － 763.

[5]覃志高，李如棟，陳志華.復方甘草片含量測定方法改進[J].中國藥業，2009，18（16）：31.