老鸛草膏對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清VEGF和TGF-β1表達的影響

萬永霞+王漢海+馮道俊

摘要：為觀察老鸛草（Ｇｅｒａｎｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ Ｍａｘｉｍ）膏對佐劑性關(guān)節(jié)炎（ＡＡ）大鼠模型血清細胞因子ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β１含量的影響，探討老鸛草對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機理，試驗將ＳＤ大鼠尾根部皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑（ＣＦＡ）造模，將造模成功的ＡＡ大鼠隨機分為３組，于第１０天開始分別以生理鹽水（模型對照組）、老鸛草膏（老鸛草膏組）和ＭＴＸ（ＭＴＸ組）處理各試驗組，同時設(shè)置空白對照組。第４５天乙醚麻醉后眼底采血、ＥＬＩＳＡ法檢測血清中ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β１的濃度。結(jié)果表明，與模型對照組和ＭＴＸ組相比，老鸛草膏可顯著降低 ＡＡ大鼠血清異常升高的ＶＥＧＦ水平，提高血清ＴＧＦ－β１含量。表明老鸛草可改善大鼠足關(guān)節(jié)狀態(tài)，具有免疫調(diào)節(jié)功能，有助于機體恢復(fù)免疫穩(wěn)定狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：佐劑性關(guān)節(jié)炎；老鸛草（Ｇｅｒａｎｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ Ｍａｘｉｍ）膏；細胞因子；甲氨蝶呤

中圖分類號：Ｒ２８５．５文獻標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）09－2111-03

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｅｒａｎｉｕｍ wｉｌｆｏｒｄｉｉ Ｍａｘｉｍ Ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ（ＧＷＭＯ） ｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｒｕｍ ＶＥＧＦ ａｎｄ ＴＧＦ－β１ ｉｎ Ｒａｔｓ ｗｉｔｈ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ （ＡＡ）

ＷＡＮ Ｙｏｎｇ－ｘｉａ， ＷＡＮＧ Ｈａｎ－ｈａｉ， ＦＥＮＧ Ｄａｏ－ｊｕｎ

（Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ／Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｗｅｉｆａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｅｉｆａｎｇ ２６１０６１， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｏ investigate the ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｅｒａｎｉｕｍ wｉｌｆｏｒｄｉｉ Ｍａｘｉｍ Ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ （ＧＷＭＯ） ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｒｕｍ ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β１ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ （ＡＡ） ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ to ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＧＷＭＯ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ （ＲＡ），６０ ＳＤ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｆｏｕｒ ｇｒｏｕｐｓ including Ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， Ｍｏｄｅｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ＧＷＭＯ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＭＴＸ ｇｒｏｕｐ． Ｅｘｃｅｐｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｔｈｒｅｅ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ＣＦＡ ａｔ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｏｆ ｔａｉｌ ｆｏｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓａｌｉｎｅ， ＧＷＭＯ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ （ＭＴＸ）， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｆｔｅｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ １０ ｄａｙｓ． Ａｆｔｅｒ ｆｉｖｅ ｗｅｅｋｓ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＶＥＧＦ ａｎｄ ＴＧＦ－β１ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒａｔｓ ｆｕｎｄｕｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＥＬＩＳＡ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＧＷＭＯ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＶＥＧＦ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｒａｔｓ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ made ｉｔ ｂａｃｋ ｔｏ ｎｏｒｍａｌ（ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ Ｐ＜０．０１， ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＭＴＸ ｇｒｏｕｐ Ｐ＜０．０１）， ａｎｄ ｒａｉｓｅ ｓｅｒｕｍ ＴＧＦ－β１ ｃｏｎｔｅｎｔ （ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ Ｐ＜０．０１， ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＭＴＸ ｇｒｏｕｐ Ｐ＜０．０５）． Ｉｔ is ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＧＷＭＯ ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ａｎｋｌｅ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｒａｔｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ to ｈｅｌｐ ｔｈｅ ｂｏｄｙ ｒｅｓｔｏｒｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： aｄｊｕｖａｎｔ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ （ＡＡ）； Ｇｅｒａｎｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ Ｍａｘｉｍ Ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ； ｃｙｔｏｋｉｎｅ； ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ＭＴＸ）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Ｒｈｅｕｍａｔｉｏｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）為一種慢性自身免疫性疾病，因能引起關(guān)節(jié)功能障礙而嚴(yán)重影響人類健康，目前已建立多種ＲＡ動物模型進行科研試驗，其中應(yīng)用廣泛且較成熟的動物模型是膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（Cｏｌｌａｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＣＩＡ）和佐劑性關(guān)節(jié)炎（Aｄｊｕｖａｎｔ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＡＡ）。有文獻報道兩種模型在臨床表現(xiàn)、實驗室指標(biāo)和病理機制上都與人臨床ＲＡ相似或相近，是研究ＲＡ、篩選抗炎免疫藥物較理想的動物模型［１，２］。

本試驗利用完全弗氏佐劑構(gòu)建了ＡＡ大鼠模型，并通過關(guān)節(jié)腫脹度及血清細胞因子ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β１的變化對比觀察分析了老鸛草（Ｇｅｒａｎｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ Ｍａｘｉｍ）膏和甲氨喋呤（ＭＴＸ）干預(yù)下模型大鼠上述指標(biāo)的變化。

１材料與方法

１．１試驗動物

ＳＤ大鼠６０只，雌３６只，雄２４只，體重（２５０±２３）ｇ，購自濟南實驗動物飼養(yǎng)所，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進行試驗。

１．２藥物與試劑

ＶＥＧＦ試劑盒、ＴＧＦ－β１試劑盒，均為美國Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司生產(chǎn)；完全弗氏佐劑，美國ｓｉｇｍａ公司生產(chǎn)；ＭＴＸ，購于濰坊市人民醫(yī)院，使用前用生理鹽水（ＮＳ）配制為０．０２５ ｍｇ／ｍＬ懸濁液。

老鸛草，６月下旬采自濰坊安丘，除去根部及雜質(zhì)，洗凈晾干切段備用。

１．３方法

１．３．１老鸛草膏的制作老鸛草磨碎后６０目標(biāo)準(zhǔn)篩分樣，以黃原膠和蜂蜜作為增稠劑，反復(fù)攪拌為膏狀，４ ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

１．３．２動物模型的制作與分組ＳＤ大鼠６０只隨機取１０只作為空白對照，其余５０只為模型組，制作佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，方法是完全弗氏佐劑（ＣＦＡ）充分振蕩搖勻后，取０．１ ｍＬ于大鼠尾根部皮內(nèi)注射，每天觀測關(guān)節(jié)腫脹度，第１０天測量后取符合模型條件的４２只隨機分為３組，每組１４只，分別為模型對照組、老鸛草膏組和ＭＴＸ組，分別以生理鹽水、老鸛草膏和ＭＴＸ處理各組。具體處理方法是：老鸛草膏組大鼠后肢關(guān)節(jié)處涂抹老鸛草膏，每天早晚各１次；ＭＴＸ組按０．０２５ ｍｇ（１ ｍＬ）／只灌胃，每周１次；模型對照組ＮＳ灌胃（１ ｍＬ／只）；空白對照組尾根部皮內(nèi)注射０．１ ｍＬ ＮＳ。每周１次，連續(xù)給藥５周（３５ ｄ）。

１．３．３關(guān)節(jié)腫脹度的觀測用螺旋千分尺測量大鼠雙后肢足墊厚度并計算關(guān)節(jié)腫脹度。各試驗組分別于注射藥物前（０ ｄ）及注射后１、３、５、7、１０、１６、３０、４５ ｄ測量。關(guān)節(jié)腫脹度計算公式如下：

關(guān)節(jié)腫脹度＝

■×１００％

１．３．４老鸛草膏對ＡＡ大鼠血清中細胞因子的影響第４５天測量后乙醚麻醉大鼠并眼底采血，２ ｍＬ／只，用 ＥＬＩＳＡ法（按照ＥＬＩＳＡ試劑盒說明書操作）檢測血清中細胞因子ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β１的濃度。

１．３．５統(tǒng)計學(xué)處理試驗數(shù)據(jù)均以ｘ±ｓ表示；結(jié)果用 ＳＰＳＳ１３１０統(tǒng)計軟件進行分析。關(guān)節(jié)腫脹度采用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗方法進行統(tǒng)計；細胞因子濃度采用單向方差分析法進行統(tǒng)計，兩組間比較采用ｔ檢驗。

２結(jié)果

２．１ＡＡ大鼠模型關(guān)節(jié)腫脹度觀測結(jié)果

大鼠致炎后３～４ ｈ出現(xiàn)癥狀，１５ ｈ足腫脹達高峰，表現(xiàn)為早期的炎癥反應(yīng)，持續(xù)２～３ ｄ逐漸減輕，７～８ ｄ后再度腫脹，且進行性加重。大鼠行動不便，體重下降，易激惹，其表現(xiàn)類似人類ＲＡ，因大鼠后足腫脹程度遠高于前足，測量時以后足為基準(zhǔn)。

由表１可見，造模第１０天大鼠后足平均厚度與空白對照組相比差異極顯著（Ｐ＜０．０１），空白對照組大鼠未見明顯反應(yīng)。４２只大鼠符合模型制備標(biāo)準(zhǔn)，制模成功率８４％。

２．２老鸛草膏干預(yù)后大鼠后足腫脹度變化

造模第１０天開始給予老鸛草膏及ＭＴＸ藥物干預(yù)，并分別于第１６、３０、４５天測量各組大鼠右后足關(guān)節(jié)厚度，其結(jié)果見表２。由表２可見，第１６天時模型對照組、老鸛草膏組、ＭＴＸ組之間大鼠右后足厚度差異不顯著（Ｐ＞０．０５），但均極顯著（Ｐ＜０．０１）高于空白對照組；第３０天時老鸛草膏組、ＭＴＸ組大鼠右后足厚度均顯著（Ｐ＜０．０５）低于模型對照組，ＭＴＸ組效果好于老鸛草膏組（Ｐ＜０．０５）；第４５天時老鸛草膏組和ＭＴＸ組右后足厚度極顯著（Ｐ＜０．０１）低于模型對照組，老鸛草膏組和ＭＴＸ組相比差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。表明老鸛草膏與ＭＴＸ皆可降低ＡＡ大鼠足關(guān)節(jié)腫脹程度，緩解運動障礙。

２．３血清細胞因子檢測結(jié)果

由表３可見，模型對照組血清中ＶＥＧＦ的含量較正常對照組升高，而ＴＧＦ－β１的含量則較正常對照組下降。連續(xù)給藥３５ ｄ后，老鸛草膏組ＴＧＦ－β１的水平與模型對照組相比有明顯升高（Ｐ＜０．０１），ＶＥＧＦ的水平與模型對照組相比明顯降低（Ｐ＜０．０１）。

３討論

ＲＡ是以多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)、以炎性的滑膜炎為特征的慢性系統(tǒng)性疾病，新生血管的形成、炎癥細胞的浸潤和滑膜細胞的增生是滑膜早期改變的標(biāo)志。ＲＡ的病理機制目前還不清楚，許多研究已經(jīng)表明淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、滑膜細胞等多種炎癥細胞介導(dǎo)的異常細胞免疫及體液免疫，導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部和全身的免疫功能紊亂，在ＲＡ的病理中起著重要作用［３］。人們已證實細胞因子ＶＥＧＦ參與了滑膜組織炎癥的形成和發(fā)展［４］，ＴＧＦ－β１可調(diào)節(jié)細胞的生長和分化，在ＲＡ活動期血清水平下降，而炎癥初期可出現(xiàn)應(yīng)激性升高抑制炎性反應(yīng)的發(fā)展［３］。因此在老鸛草膏對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的干預(yù)試驗中測定了這些數(shù)值的變化。

試驗測定表明老鸛草全草含老鸛草鞣質(zhì)（Gｅｒａｎｉｉｎ）及金絲桃苷（Hｙｐｅｒｉｎ）等成分，其主要作用是抗菌止瀉、祛風(fēng)活血等［５，６］，在濰坊地區(qū)當(dāng)?shù)厝藗兘?jīng)常將其鮮草搗碎敷于關(guān)節(jié)表面或全草浸酒治療關(guān)節(jié)炎癥且有一定效果。本試驗采用老鸛草膏外用，觀察對ＡＡ大鼠關(guān)節(jié)腫脹度及血清細胞因子ＶＥＧＦ和ＴＧＦ－β１的影響，試驗結(jié)果表明，經(jīng)過老鸛草膏連續(xù)給藥３５ ｄ后，ＡＡ大鼠足關(guān)節(jié)腫脹度得到明顯改善（Ｐ＜０．０１），血清學(xué)檢測也顯示ＴＧＦ－β１的水平與ＡＡ模型對照組比較有明顯升高（Ｐ＜０．０１），ＶＥＧＦ的水平與ＡＡ模型對照組相比明顯降低（Ｐ＜０．０１），這與ＭＴＸ灌胃相比從檢測指標(biāo)看療效略低。需要注意的是，本次試驗采用單味老鸛草膏外用，但制作老鸛草膏時因加入了蜂蜜等增稠成分，以及老鸛草對皮膚有一定刺激作用，大鼠經(jīng)常舔食涂抹的膏劑，必然有部分老鸛草膏會通過消化道進入體內(nèi)，因此在用藥后期，多數(shù)大鼠出現(xiàn)不同程度的腹瀉癥狀（這也表明雖然老鸛草膏有止瀉作用，但長時間或較大劑量使用時能促進大腸的蠕動而出現(xiàn)瀉下），導(dǎo)致大鼠食欲降低、體重減輕，有３只大鼠因腹瀉死亡，由此提示長期使用老鸛草治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時，要注意控制經(jīng)消化道攝入的量，外用時最好組方以提高療效。同時ＭＴＸ組在試驗后期也有２只因腹瀉致死。

４結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，經(jīng)過老鸛草膏連續(xù)給藥３５ ｄ后，大鼠足腫脹度得到明顯改善。血清學(xué)檢測也顯示ＶＥＧＦ和ＴＧＦ－β１的水平有明顯改善。老鸛草能降低ＡＡ大鼠足關(guān)節(jié)腫脹度，緩解癥狀，老鸛草也能調(diào)節(jié)血清中細胞因子的水平，可在免疫水平進行保護性調(diào)節(jié)，提示對人ＲＡ的治療有一定作用。

參考文獻：

［１］ 劉元剛，劉樹滔，饒平凡．類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎嚙齒動物模型的研究進展［Ｊ］．中國實驗動物學(xué)報，２００７，１５（６）：４７０－４７３．

［２］ 陸聲，梁崇禮，林月秋．類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型應(yīng)用研究進展［Ｊ］．中國實驗動物學(xué)雜志，２００１，１１（２）：１１２－１１４．

［３］ 張荒生，陳麗川，王進軍，等．痹痛定分散片對大鼠ＡＡ模型血清ＴＧＦ－β１及滑膜組織病理形態(tài)學(xué)的影響［Ｊ］．光明中醫(yī)，２００９，２４（４）：６４８－６５１．

［４］ 梁清華，何金華，李霞玲，等．痹腫消湯對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜ＶＥＧＦ表達水平的影響［Ｊ］．湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，２００２，２７（６）：４９１－４９４．

［５］ 雷海民，李強，柏冬，等．粗根老鸛草化學(xué)成分的研究［Ｊ］．中國中藥雜志，２００７（４）：３４８－３４９．

［６］ 邢濤．老鸛草中黃酮類成分的藥理、生物學(xué)作用［Ｊ］．吉林畜牧獸醫(yī)，２００９（５）：１１－１３．

１．３．３關(guān)節(jié)腫脹度的觀測用螺旋千分尺測量大鼠雙后肢足墊厚度并計算關(guān)節(jié)腫脹度。各試驗組分別于注射藥物前（０ ｄ）及注射后１、３、５、7、１０、１６、３０、４５ ｄ測量。關(guān)節(jié)腫脹度計算公式如下：

關(guān)節(jié)腫脹度＝

■×１００％

１．３．４老鸛草膏對ＡＡ大鼠血清中細胞因子的影響第４５天測量后乙醚麻醉大鼠并眼底采血，２ ｍＬ／只，用 ＥＬＩＳＡ法（按照ＥＬＩＳＡ試劑盒說明書操作）檢測血清中細胞因子ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β１的濃度。

１．３．５統(tǒng)計學(xué)處理試驗數(shù)據(jù)均以ｘ±ｓ表示；結(jié)果用 ＳＰＳＳ１３１０統(tǒng)計軟件進行分析。關(guān)節(jié)腫脹度采用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗方法進行統(tǒng)計；細胞因子濃度采用單向方差分析法進行統(tǒng)計，兩組間比較采用ｔ檢驗。

２結(jié)果

２．１ＡＡ大鼠模型關(guān)節(jié)腫脹度觀測結(jié)果

大鼠致炎后３～４ ｈ出現(xiàn)癥狀，１５ ｈ足腫脹達高峰，表現(xiàn)為早期的炎癥反應(yīng)，持續(xù)２～３ ｄ逐漸減輕，７～８ ｄ后再度腫脹，且進行性加重。大鼠行動不便，體重下降，易激惹，其表現(xiàn)類似人類ＲＡ，因大鼠后足腫脹程度遠高于前足，測量時以后足為基準(zhǔn)。

由表１可見，造模第１０天大鼠后足平均厚度與空白對照組相比差異極顯著（Ｐ＜０．０１），空白對照組大鼠未見明顯反應(yīng)。４２只大鼠符合模型制備標(biāo)準(zhǔn)，制模成功率８４％。

２．２老鸛草膏干預(yù)后大鼠后足腫脹度變化

造模第１０天開始給予老鸛草膏及ＭＴＸ藥物干預(yù)，并分別于第１６、３０、４５天測量各組大鼠右后足關(guān)節(jié)厚度，其結(jié)果見表２。由表２可見，第１６天時模型對照組、老鸛草膏組、ＭＴＸ組之間大鼠右后足厚度差異不顯著（Ｐ＞０．０５），但均極顯著（Ｐ＜０．０１）高于空白對照組；第３０天時老鸛草膏組、ＭＴＸ組大鼠右后足厚度均顯著（Ｐ＜０．０５）低于模型對照組，ＭＴＸ組效果好于老鸛草膏組（Ｐ＜０．０５）；第４５天時老鸛草膏組和ＭＴＸ組右后足厚度極顯著（Ｐ＜０．０１）低于模型對照組，老鸛草膏組和ＭＴＸ組相比差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。表明老鸛草膏與ＭＴＸ皆可降低ＡＡ大鼠足關(guān)節(jié)腫脹程度，緩解運動障礙。

２．３血清細胞因子檢測結(jié)果

由表３可見，模型對照組血清中ＶＥＧＦ的含量較正常對照組升高，而ＴＧＦ－β１的含量則較正常對照組下降。連續(xù)給藥３５ ｄ后，老鸛草膏組ＴＧＦ－β１的水平與模型對照組相比有明顯升高（Ｐ＜０．０１），ＶＥＧＦ的水平與模型對照組相比明顯降低（Ｐ＜０．０１）。

３討論

ＲＡ是以多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)、以炎性的滑膜炎為特征的慢性系統(tǒng)性疾病，新生血管的形成、炎癥細胞的浸潤和滑膜細胞的增生是滑膜早期改變的標(biāo)志。ＲＡ的病理機制目前還不清楚，許多研究已經(jīng)表明淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、滑膜細胞等多種炎癥細胞介導(dǎo)的異常細胞免疫及體液免疫，導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部和全身的免疫功能紊亂，在ＲＡ的病理中起著重要作用［３］。人們已證實細胞因子ＶＥＧＦ參與了滑膜組織炎癥的形成和發(fā)展［４］，ＴＧＦ－β１可調(diào)節(jié)細胞的生長和分化，在ＲＡ活動期血清水平下降，而炎癥初期可出現(xiàn)應(yīng)激性升高抑制炎性反應(yīng)的發(fā)展［３］。因此在老鸛草膏對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的干預(yù)試驗中測定了這些數(shù)值的變化。

試驗測定表明老鸛草全草含老鸛草鞣質(zhì)（Gｅｒａｎｉｉｎ）及金絲桃苷（Hｙｐｅｒｉｎ）等成分，其主要作用是抗菌止瀉、祛風(fēng)活血等［５，６］，在濰坊地區(qū)當(dāng)?shù)厝藗兘?jīng)常將其鮮草搗碎敷于關(guān)節(jié)表面或全草浸酒治療關(guān)節(jié)炎癥且有一定效果。本試驗采用老鸛草膏外用，觀察對ＡＡ大鼠關(guān)節(jié)腫脹度及血清細胞因子ＶＥＧＦ和ＴＧＦ－β１的影響，試驗結(jié)果表明，經(jīng)過老鸛草膏連續(xù)給藥３５ ｄ后，ＡＡ大鼠足關(guān)節(jié)腫脹度得到明顯改善（Ｐ＜０．０１），血清學(xué)檢測也顯示ＴＧＦ－β１的水平與ＡＡ模型對照組比較有明顯升高（Ｐ＜０．０１），ＶＥＧＦ的水平與ＡＡ模型對照組相比明顯降低（Ｐ＜０．０１），這與ＭＴＸ灌胃相比從檢測指標(biāo)看療效略低。需要注意的是，本次試驗采用單味老鸛草膏外用，但制作老鸛草膏時因加入了蜂蜜等增稠成分，以及老鸛草對皮膚有一定刺激作用，大鼠經(jīng)常舔食涂抹的膏劑，必然有部分老鸛草膏會通過消化道進入體內(nèi)，因此在用藥后期，多數(shù)大鼠出現(xiàn)不同程度的腹瀉癥狀（這也表明雖然老鸛草膏有止瀉作用，但長時間或較大劑量使用時能促進大腸的蠕動而出現(xiàn)瀉下），導(dǎo)致大鼠食欲降低、體重減輕，有３只大鼠因腹瀉死亡，由此提示長期使用老鸛草治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時，要注意控制經(jīng)消化道攝入的量，外用時最好組方以提高療效。同時ＭＴＸ組在試驗后期也有２只因腹瀉致死。

４結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，經(jīng)過老鸛草膏連續(xù)給藥３５ ｄ后，大鼠足腫脹度得到明顯改善。血清學(xué)檢測也顯示ＶＥＧＦ和ＴＧＦ－β１的水平有明顯改善。老鸛草能降低ＡＡ大鼠足關(guān)節(jié)腫脹度，緩解癥狀，老鸛草也能調(diào)節(jié)血清中細胞因子的水平，可在免疫水平進行保護性調(diào)節(jié)，提示對人ＲＡ的治療有一定作用。

參考文獻：

［１］ 劉元剛，劉樹滔，饒平凡．類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎嚙齒動物模型的研究進展［Ｊ］．中國實驗動物學(xué)報，２００７，１５（６）：４７０－４７３．

［２］ 陸聲，梁崇禮，林月秋．類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型應(yīng)用研究進展［Ｊ］．中國實驗動物學(xué)雜志，２００１，１１（２）：１１２－１１４．

［３］ 張荒生，陳麗川，王進軍，等．痹痛定分散片對大鼠ＡＡ模型血清ＴＧＦ－β１及滑膜組織病理形態(tài)學(xué)的影響［Ｊ］．光明中醫(yī)，２００９，２４（４）：６４８－６５１．

［４］ 梁清華，何金華，李霞玲，等．痹腫消湯對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜ＶＥＧＦ表達水平的影響［Ｊ］．湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，２００２，２７（６）：４９１－４９４．

［５］ 雷海民，李強，柏冬，等．粗根老鸛草化學(xué)成分的研究［Ｊ］．中國中藥雜志，２００７（４）：３４８－３４９．

［６］ 邢濤．老鸛草中黃酮類成分的藥理、生物學(xué)作用［Ｊ］．吉林畜牧獸醫(yī)，２００９（５）：１１－１３．

１．３．３關(guān)節(jié)腫脹度的觀測用螺旋千分尺測量大鼠雙后肢足墊厚度并計算關(guān)節(jié)腫脹度。各試驗組分別于注射藥物前（０ ｄ）及注射后１、３、５、7、１０、１６、３０、４５ ｄ測量。關(guān)節(jié)腫脹度計算公式如下：

關(guān)節(jié)腫脹度＝

■×１００％

１．３．４老鸛草膏對ＡＡ大鼠血清中細胞因子的影響第４５天測量后乙醚麻醉大鼠并眼底采血，２ ｍＬ／只，用 ＥＬＩＳＡ法（按照ＥＬＩＳＡ試劑盒說明書操作）檢測血清中細胞因子ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β１的濃度。

１．３．５統(tǒng)計學(xué)處理試驗數(shù)據(jù)均以ｘ±ｓ表示；結(jié)果用 ＳＰＳＳ１３１０統(tǒng)計軟件進行分析。關(guān)節(jié)腫脹度采用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗方法進行統(tǒng)計；細胞因子濃度采用單向方差分析法進行統(tǒng)計，兩組間比較采用ｔ檢驗。

２結(jié)果

２．１ＡＡ大鼠模型關(guān)節(jié)腫脹度觀測結(jié)果

大鼠致炎后３～４ ｈ出現(xiàn)癥狀，１５ ｈ足腫脹達高峰，表現(xiàn)為早期的炎癥反應(yīng)，持續(xù)２～３ ｄ逐漸減輕，７～８ ｄ后再度腫脹，且進行性加重。大鼠行動不便，體重下降，易激惹，其表現(xiàn)類似人類ＲＡ，因大鼠后足腫脹程度遠高于前足，測量時以后足為基準(zhǔn)。

由表１可見，造模第１０天大鼠后足平均厚度與空白對照組相比差異極顯著（Ｐ＜０．０１），空白對照組大鼠未見明顯反應(yīng)。４２只大鼠符合模型制備標(biāo)準(zhǔn)，制模成功率８４％。

２．２老鸛草膏干預(yù)后大鼠后足腫脹度變化

造模第１０天開始給予老鸛草膏及ＭＴＸ藥物干預(yù)，并分別于第１６、３０、４５天測量各組大鼠右后足關(guān)節(jié)厚度，其結(jié)果見表２。由表２可見，第１６天時模型對照組、老鸛草膏組、ＭＴＸ組之間大鼠右后足厚度差異不顯著（Ｐ＞０．０５），但均極顯著（Ｐ＜０．０１）高于空白對照組；第３０天時老鸛草膏組、ＭＴＸ組大鼠右后足厚度均顯著（Ｐ＜０．０５）低于模型對照組，ＭＴＸ組效果好于老鸛草膏組（Ｐ＜０．０５）；第４５天時老鸛草膏組和ＭＴＸ組右后足厚度極顯著（Ｐ＜０．０１）低于模型對照組，老鸛草膏組和ＭＴＸ組相比差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。表明老鸛草膏與ＭＴＸ皆可降低ＡＡ大鼠足關(guān)節(jié)腫脹程度，緩解運動障礙。

２．３血清細胞因子檢測結(jié)果

由表３可見，模型對照組血清中ＶＥＧＦ的含量較正常對照組升高，而ＴＧＦ－β１的含量則較正常對照組下降。連續(xù)給藥３５ ｄ后，老鸛草膏組ＴＧＦ－β１的水平與模型對照組相比有明顯升高（Ｐ＜０．０１），ＶＥＧＦ的水平與模型對照組相比明顯降低（Ｐ＜０．０１）。

３討論

ＲＡ是以多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)、以炎性的滑膜炎為特征的慢性系統(tǒng)性疾病，新生血管的形成、炎癥細胞的浸潤和滑膜細胞的增生是滑膜早期改變的標(biāo)志。ＲＡ的病理機制目前還不清楚，許多研究已經(jīng)表明淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、滑膜細胞等多種炎癥細胞介導(dǎo)的異常細胞免疫及體液免疫，導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部和全身的免疫功能紊亂，在ＲＡ的病理中起著重要作用［３］。人們已證實細胞因子ＶＥＧＦ參與了滑膜組織炎癥的形成和發(fā)展［４］，ＴＧＦ－β１可調(diào)節(jié)細胞的生長和分化，在ＲＡ活動期血清水平下降，而炎癥初期可出現(xiàn)應(yīng)激性升高抑制炎性反應(yīng)的發(fā)展［３］。因此在老鸛草膏對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的干預(yù)試驗中測定了這些數(shù)值的變化。

試驗測定表明老鸛草全草含老鸛草鞣質(zhì)（Gｅｒａｎｉｉｎ）及金絲桃苷（Hｙｐｅｒｉｎ）等成分，其主要作用是抗菌止瀉、祛風(fēng)活血等［５，６］，在濰坊地區(qū)當(dāng)?shù)厝藗兘?jīng)常將其鮮草搗碎敷于關(guān)節(jié)表面或全草浸酒治療關(guān)節(jié)炎癥且有一定效果。本試驗采用老鸛草膏外用，觀察對ＡＡ大鼠關(guān)節(jié)腫脹度及血清細胞因子ＶＥＧＦ和ＴＧＦ－β１的影響，試驗結(jié)果表明，經(jīng)過老鸛草膏連續(xù)給藥３５ ｄ后，ＡＡ大鼠足關(guān)節(jié)腫脹度得到明顯改善（Ｐ＜０．０１），血清學(xué)檢測也顯示ＴＧＦ－β１的水平與ＡＡ模型對照組比較有明顯升高（Ｐ＜０．０１），ＶＥＧＦ的水平與ＡＡ模型對照組相比明顯降低（Ｐ＜０．０１），這與ＭＴＸ灌胃相比從檢測指標(biāo)看療效略低。需要注意的是，本次試驗采用單味老鸛草膏外用，但制作老鸛草膏時因加入了蜂蜜等增稠成分，以及老鸛草對皮膚有一定刺激作用，大鼠經(jīng)常舔食涂抹的膏劑，必然有部分老鸛草膏會通過消化道進入體內(nèi)，因此在用藥后期，多數(shù)大鼠出現(xiàn)不同程度的腹瀉癥狀（這也表明雖然老鸛草膏有止瀉作用，但長時間或較大劑量使用時能促進大腸的蠕動而出現(xiàn)瀉下），導(dǎo)致大鼠食欲降低、體重減輕，有３只大鼠因腹瀉死亡，由此提示長期使用老鸛草治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時，要注意控制經(jīng)消化道攝入的量，外用時最好組方以提高療效。同時ＭＴＸ組在試驗后期也有２只因腹瀉致死。

４結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，經(jīng)過老鸛草膏連續(xù)給藥３５ ｄ后，大鼠足腫脹度得到明顯改善。血清學(xué)檢測也顯示ＶＥＧＦ和ＴＧＦ－β１的水平有明顯改善。老鸛草能降低ＡＡ大鼠足關(guān)節(jié)腫脹度，緩解癥狀，老鸛草也能調(diào)節(jié)血清中細胞因子的水平，可在免疫水平進行保護性調(diào)節(jié)，提示對人ＲＡ的治療有一定作用。

參考文獻：

［１］ 劉元剛，劉樹滔，饒平凡．類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎嚙齒動物模型的研究進展［Ｊ］．中國實驗動物學(xué)報，２００７，１５（６）：４７０－４７３．

［２］ 陸聲，梁崇禮，林月秋．類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型應(yīng)用研究進展［Ｊ］．中國實驗動物學(xué)雜志，２００１，１１（２）：１１２－１１４．

［３］ 張荒生，陳麗川，王進軍，等．痹痛定分散片對大鼠ＡＡ模型血清ＴＧＦ－β１及滑膜組織病理形態(tài)學(xué)的影響［Ｊ］．光明中醫(yī)，２００９，２４（４）：６４８－６５１．

［４］ 梁清華，何金華，李霞玲，等．痹腫消湯對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜ＶＥＧＦ表達水平的影響［Ｊ］．湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，２００２，２７（６）：４９１－４９４．

［５］ 雷海民，李強，柏冬，等．粗根老鸛草化學(xué)成分的研究［Ｊ］．中國中藥雜志，２００７（４）：３４８－３４９．

［６］ 邢濤．老鸛草中黃酮類成分的藥理、生物學(xué)作用［Ｊ］．吉林畜牧獸醫(yī)，２００９（５）：１１－１３．