羽衣甘藍SSR反應體系的優化

劉暢+祝朋芳+房霞+康耀海+趙穎

摘要：為優化羽衣甘藍（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ）ＳＳＲ反應體系，并利用優化的體系進行引物的篩選。采用單因素完全隨機試驗篩選各反應因素的最佳水平，并采用Ｌ１６（４５）正交設計進行試驗優化，建立了羽衣甘藍ＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反應體系。結果表明，各因素不同水平濃度對擴增結果均有一定影響，羽衣甘藍基因組ＤＮＡ的最佳ＳＳＲ反應體系為ＤＮＡ模板量（５０ ｎｇ／μＬ）１．０ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １．０ μＬ，引物量（２．０ μｍｏｌ／Ｌ）上下游各３．０ μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．８ μＬ，Ｔａｑ聚合酶（５ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １．０ μＬ，總體積１０ μＬ。檢測了優化體系的穩定性，利用優化的反應體系對蕓薹屬植物 ２０對ＳＳＲ引物進行擴增并用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，在所選用的２０對引物中，１８對擴增出了清晰的條帶，１１對具有特異擴增條帶，多態性引物比率為６１％，驗證了該體系可用于羽衣甘藍ＳＳＲ－ＰＣＲ擴增和ＳＳＲ引物的篩選。

關鍵詞：羽衣甘藍（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ）；ＳＳＲ；正交設計；體系優化

中圖分類號：Ｓ６３５．９文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）09－2079-04

Optimizing SSR System of Brassica oleracea var. acephala

ＬＩＵ Ｃｈａｎｇ１，ＺＨＵ Ｐｅｎｇ－ｆａｎｇ１，ＦＡＮＧ Ｘｉａ１，ＫＡＮＧ Ｙａｏ－ｈａｉ１，ＺＨＡＯ Ｙｉｎｇ１，２

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｕｒｂａｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１２２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ＳＳＲ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｒａｎｄｏｍ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ＳＳＲ－ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌ１６（４５） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅａｃｈ ｆａｃｔｏｒ ｈａｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ（５０ ｎｇ／μＬ） １．０ μＬ， １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ１．０ μＬ， ２．０ μｍｏｌ／Ｌ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ３．０ μＬ ｅａｃｈ， ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．８ μＬ， Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ） ０．２ μＬ ａｎｄ ｄｄＨ２Ｏ １．０ μＬ． Ｔｗｅｎｔｙ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｅｉｇｈｔｅｅｎ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｈａｄ ｃｌｅａｒ ｂａｎｄｓ ａｎｄ ｅｌｅｖｅｎ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ６１％． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＳＳＲ－ＰＣＲ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ； ＳＳＲ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ； ｓｙｓｔｅｍ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

羽衣甘藍（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ）是十字花科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）蕓薹屬（Ｂｒａｓｓｉｃａ）觀賞植物，又名葉牡丹，觀賞價值高，耐寒性強。開展羽衣甘藍遺傳育種相關研究工作是其應用的關鍵，由于我國近十幾年才開始引種栽培羽衣甘藍，目前較多的研究集中在組織培養及主要園藝性狀的初步遺傳規律分析等方面。

分子標記技術目前已成為現代遺傳學研究的重點，在諸如ＳＲＡＰ、ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＳＲ、ＡＦＬＰ等諸多分子標記中，ＳＳＲ標記基于ＰＣＲ，操作安全簡單，多態性好，穩定性強，且多數為共顯性［１，２］，是優良的基因組特異標記類型，近年來在蕓薹屬植物上得到了較廣泛的開發。近緣屬植物相關研究中，ＳＳＲ標記主要集中在油菜、甘藍、白菜等作物中，目前尚未見羽衣甘藍ＳＳＲ反應體系優化的相關研究。關于植物分子標記反應體系優化方面的研究，國內以采用正交試驗獲得最優反應體系較多［３－１１］。為此，在前人相關研究的基礎上，對羽衣甘藍ＳＳＲ－ＰＣＲ反應體系進行了研究，得到了一套適合于羽衣甘藍基因組ＤＮＡ擴增的反應體系，為后續相關研究奠定了基礎。

１材料與方法

１．１材料

以羽衣甘藍自交系為試材。ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍｇ２＋）、Ｄ２０００ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ等分子生物學試劑購于天根生化科技有限公司。采用ＣＴＡＢ法［１２，１３］提取羽衣甘藍基因組ＤＮＡ， 用１％的瓊脂糖凝膠檢測ＤＮＡ質量，－２０ ℃保存用于ＰＣＲ擴增。

１．２ＳＳＲ擴增反應體系的優化

ＳＳＲ引物根據蕓薹屬基因庫信息源（ＢＲＡＤ，ｔｈｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｄａｔａｂａｓｅ，ｈｔｔｐ：／／ｂｒａｓｓｉｃａｄｂ．ｏｒｇ）公告的蕓薹屬作物引物序列，由金斯瑞生物工程技術有限公司合成。

ＳＳＲ反應體系總體積１０ μＬ，包括５０ ｎｇ／μＬ的模板ＤＮＡ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ，２ μｍｏｌ／Ｌ的引物，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ及５Ｕ／μＬ的Ｔａｑ聚合酶。為了確定這５個因素在ＰＣＲ反應中的最佳水平，采用單因素完全隨機試驗和正交試驗，運用引物ＢＮ１２Ａ進行擴增。引物ＢＮ１２Ａ序列：５′端Ｆｏｒｗａｒｄ：５′－ＧＣＣＧＴＴＣＴＡＧＧＧＴＴＴ

ＧＴＧＧＧＡ－３′， Ｔｍ：４９．５９ ℃； ３′端Ｒｅｖｅｒｓｅ：５′－ＧＡＧＧＡ

ＡＧＴＧＡＧＡＧＣＧＧＧＡＡＡＴＣＡ－３′，Ｔｍ：５２．３７ ℃。單因素完全隨機試驗選取了5個因素，各因素均設４個水平，逐個優化其他反應成分的水平，以確定相對較優的因素組合。該部分試驗中，逐一研究反應體系中１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ及引物的用量對擴增結果的影響。即當針對某種組分進行試驗時，其他組分的用量不變。

Ｌ１６（４５）正交試驗因素與水平見表１，ＰＣＲ反應正交試驗設計見表２。

１．３擴增產物和反應體系穩定性的檢測

ＳＳＲ反應程序為：９４ ℃預變性３ ｍｉｎ，９４ ℃變性４５ ｓ，４０～５５ ℃（需根據Ｔｍ值確定）復性４５ ｓ，７２ ℃延伸４５ ｓ，３５個循環；７２ ℃延伸７ ｍｉｎ；４ ℃保存。擴增反應結束后，在擴增產物中加入４ μＬ ＰＣＲ產物和１ μＬ ６×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ混勻，２．０％的瓊脂糖凝膠檢測。或上樣４ μＬ于５％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，在１×ＴＢＥ的電極緩沖液中電泳檢測，采用銀染法染色。

選用２０對ＳＳＲ引物優化后的最佳反應體系、反應程序進行ＳＳＲ反應體系穩定性檢測。

２結果與分析

２．１羽衣甘藍基因組ＤＮＡ質量檢測

將提取的羽衣甘藍基因組ＤＮＡ經分光光度計檢測，發現其ＯＤ２６０ ｎｍ／ＯＤ２８０ nｍ均在１．８～２．０之間，又經１％瓊脂糖凝膠電泳檢測，ＤＮＡ呈現一條亮帶，條帶清晰，無明顯的拖尾現象（圖１），說明提取的ＤＮＡ純度均一。純度和濃度檢測結果相互驗證，說明提取的ＤＮＡ合格，可以滿足后續的ＰＣＲ反應要求，為下一步的ＰＣＲ擴增篩選ＳＳＲ引物提供了有力的保障。

２．２羽衣甘藍ＳＳＲ反應體系的優化

２．２．1單因素完全隨機試驗篩選結果由圖2 可知，ｄＮＴＰｓ的體積在０．４～０．８ μＬ時擴增效果比較好，可擴增出清晰的條帶，其中以０．８ μＬ的ｄＮＴＰｓ擴增出的特異性條帶最多且最清晰。當ｄＮＴＰｓ體積達到１．０ μＬ時擴增出的條帶很少且很淺不清晰，可能是由于高濃度ｄＮＴＰｓ易與Ｔａｑ酶競爭，結合了Ｍｇ２+，降低了酶活性；而ｄＮＴＰｓ濃度低時，影響擴增產物形成，擴增量少，條帶較弱。

從圖3可以看出，ＤＮＡ模板量在０．５～１．０ μＬ時，對ＳＳＲ的擴增沒有明顯的影響，但１．０ μＬ的ＤＮＡ模板擴增出的條帶要比０．５ μＬ的ＤＮＡ模板擴增出的特異性條帶多且清晰。但當ＤＮＡ模板量大于１．５ μＬ時，ＳＳＲ擴增結果出現了非特異性的擴增條帶且雜帶較多。

從圖4可以看出，Taq DNA聚合酶的體積為0.1 μL時特異性條帶很淡，在0.2~0.4 μL時擴增的帶型較穩定且清晰。而當Taq DNA聚合酶的體積為0.6 μL時出現了較淡的非特異性條帶。

從圖５可以看出，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ的體積在１．０～１．５ μＬ時條帶較清晰明顯，但１．０ μＬ的１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ的特異性條帶要比１．５ μＬ的亮。相反，當１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ體積大于２．０ μＬ時，擴增結果出現了較淡的非特異性條帶。

從圖６可以看出，當引物量較低（小于２.0 μＬ）時擴增出的條帶很少，當引物量在２．５~3.0μＬ時擴增出的條帶較多，尤其引物量為３.0 μＬ時擴增出的條帶更清晰。由此應選用３.0 μＬ左右的引物用量。

２．２．2正交試驗結果按照表２的１６個組合進行ＰＣＲ反應后的電泳結果見圖7。從圖7可以看出，在１６個處理組合中，由于Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ和引物５個因素的用量不同， 擴增的效果存在明顯的差異。組合１、２基本沒有條帶，組合３、４、６、１２條帶較少且較淡，組合５條帶最多且很清晰。為了能擴增出清晰度高、穩定性強的條帶， 選用組合５為最佳反應體系，即ＤＮＡ模板量（５０ ｎｇ／μＬ）１．０ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １．０ μＬ，引物量（２．０ μｍｏｌ／Ｌ）上下游各３．０ μＬ， ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．８ μＬ，Ｔａｑ聚合酶（５ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ。

綜合單因素完全隨機試驗和正交試驗的結果，認為適合羽衣甘藍基因組ＤＮＡ的最佳ＳＳＲ反應體系為：ＤＮＡ模板量（５０ ｎｇ／ μＬ）１．０ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ１．０ μＬ，引物量（２．０ μｍｏｌ／Ｌ）上下游各３．０ μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．８ μＬ，Ｔａｑ聚合酶（５ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １．０ μＬ。

２．３ＳＳＲ反應體系穩定性的檢測

采用分辨率更高的聚丙烯酰胺凝膠，利用上述構建的最優反應體系，在所選用的２０對引物中，１８對引物能擴增出清晰的條帶（圖8），篩選出具有特異擴增條帶的ＳＳＲ引物１１對，多態性引物占有率為６１％。由此認為，上述建立的ＳＳＲ－ＰＣＲ反應體系穩定性較好，適合于羽衣甘藍基因組ＤＮＡ的擴增。

３小結與討論

ＳＳＲ體系的優化是以其ＰＣＲ擴增能力為尺度對模板ＤＮＡ或其他因素進行調整，從而獲得最佳的擴增能力。ＳＳＲ－ＰＣＲ對反應條件的變化比較敏感，外界因素的不同會使ＳＳＲ的擴增結果不同。ＰＣＲ反應是由耐高溫的Ｔａｑ酶催化，但不同公司生產的不同質量的Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶的擴增效果會有一定差異，從而導致Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶的最佳用量也不會完全一樣。試驗中所用的Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶為天根生化科技有限公司生產，從一定程度上保證了關鍵因子的一致性。在ＳＳＲ擴增反應中Ｍｇ２＋主要來源于Ｂｕｆｆｅｒ，由于本研究所采用的與Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶配套，使用的１０×Ｂｕｆｆｅｒ中已含ＭｇＣｌ２， 因而Ｍｇ２＋濃度被固定，并未對其中所含的Ｍｇ２＋的最適宜濃度進行研究，這與前人的研究有所不同。

試驗中除Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、１０×ＰＣＲ Bｕｆｆｅｒ、模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ和引物等主要因素外，所使用的儀器、試劑、操作手法等因素也會對反應體系造成影響。為保證試驗結果的可靠性，是在一致的試驗條件下完成的，一定程度上保證了反應體系的統一和穩定性，從而有利于提高試驗結果的可靠性，為后續試驗如多態性引物篩選、特異性標記的獲得等打下了堅實的基礎。

ＳＳＲ－ＰＣＲ反應體系的獲得主要以單因素、完全試驗、正交試驗３種方法為主。相比較而言，單因素獲得的反應體系方法簡單易行，需進行多次的單因素梯度試驗，忽略了各因素間的交互作用。完全試驗考慮到了所有的組合方式，但試驗組合數較多，工作量較大，費時費力。多因素的正交設計試驗，利用正交表的均衡分散性和整齊可比性，既能減少試驗規模又能快速地找出最優的反應體系，是篩選ＰＣＲ反應的一種有效方法［１３－１５］。試驗首先用單因素完全隨機試驗大范圍識別SSR反應體系中的關鍵影響因素的用量，再利用正交設計確定其最適用量。單因素完全隨機試驗的單因素因子不會影響其他因子評價，但也不能兼顧各因素間的交互作用，所以需先用單因素完全隨機試驗大范圍確定影響因素的用量再用正交試驗確定其最佳用量。試驗采用了單因素試驗和正交試驗兩種方法，但對于結果的判斷通過直觀的電泳圖譜進行定性或評分法對各處理體系進行篩選也存在一定的主觀性，因此也缺乏一定的可靠性。

在獲得最佳反應體系后，要檢測反應體系的穩定性以驗證反應體系是否為最佳。試驗繼而選用２０對引物，利用以上優化后的反應體系進行擴增反應，獲得了９０％的擴增率。此外，利用不同的ＳＳＲ引物檢測多態性時，由于不同引物的Ｔｍ不同，因而采用的最適Ｔｍ也不同，試驗中可參考引物設計合成時的退火溫度或通過梯度ＰＣＲ儀篩選引物的最佳退火溫度。試驗建立的一套完善的適用于羽衣甘藍的ＳＳＲ標準體系，將有助于為羽衣甘藍重要性狀分子標記的相關研究奠定基礎。

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