VEGF基因轉染間充質干細胞移植與單純間充質干細胞移植對大鼠心肌梗死的療效對比

朱磊+李鯤鵬+馬捷

[摘要] 目的 探討VEGF基因轉染骨髓間充質干細胞與單純骨髓間充質干細胞移植對大鼠心肌梗死的療效。 方法 將SD大鼠建立心肌缺血模型，1周后隨機取30只采用隨機分組法分為3組，A組為聯合移植組，B組為單純干細胞移植組，C組為對照組，通過一系列檢測，對比3組的療效。 結果 A組的療效優于B組和C組，B組的療效優于C組（P＜0.05）。 結論 VEGF基因轉染骨髓間充質干細胞移植比單純骨髓間充質干細胞移植的綜合療效好。

[關鍵詞] 心肌梗死；血管內皮細胞生長因子；骨髓間充質干細胞；基因轉染

[中圖分類號] R542.2+2[文獻標識碼] A[文章編號] 1674-4721（2014）03（c）-0009-03

Curative effect comparison of mesenchymal stem cell transplantation by VEGF gene transfection and simple mesenchymal stem cell transplantation in rat with myocardial infarction

ZHU Lei LI Kun-peng MA Jie

The Second Clinical Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

[Abstract] Objective To investigate the curative effect comparison of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation by VEGF gene transfection and simple bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat with myocardial infarction.Methods The myocardial ischemia model of SD rat was established,after 1 week and 30 rats were randomly selected and divided into 3 groups,group A was transplantation group,group B was simple stem cell transplantation group,group C was control group.Through a series of tests,curative effect of three groups was compared.Results Curative effect in Group A was better than that in group B and group C respectively,curative effect in group B was better than that in group C(P＜0.05).Conclusion The comprehensive curative effect of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation by VEGF gene transfection is better than that of simple bone marrow mesenchymal stem cell transplantation.

[Key words] Myocardial infarction;Vascular endothelial growth factor;Bone marrow mesenchymal stem cells;Gene transfection

臨床上心肌缺血多發生在40歲以后，但隨著人民生活水平的提高，目前心肌缺血在我國的患病率呈逐年上升趨勢。以往多采用傳統方法治療心肌缺血，如藥物治療、介入治療及外科手術治療（冠狀動脈旁路移植術）。近年來，隨著人們對骨髓間充質干細胞研究的深入，骨髓間充質干細胞和血管內皮生長因子（VEGF）基因轉染間充質干細胞對心肌缺血均有一定的療效，在治療心肌缺血方面已表現出傳統治療方法所無可比擬的優越性[1]，但是這兩種方法究竟哪一種療效更好，少有報道。骨髓間充質干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細胞，屬于成體干細胞的一種，在適當微環境和影響因子的作用下可以分化為多個胚層來源的細胞，甚至可以重建簡單的組織結構，且其在體外的低免疫原性，為間充質干細胞在臨床上的應用提供了可能性[2-3]。VEGF是一種特異性促使血管內皮細胞增殖的有絲分裂原，是機體內促進血管生成最主要的生長因子，功能是促進血管內皮細胞生長，啟動血管形成和增加血管通透性，能與內皮細胞表面的特異性受體結合，強烈地促進血管內皮細胞增殖，誘導血管生成，在胚胎發育、創傷修復、側支循環建立等病理生理過程中發揮重要作用[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠（山西醫科大學動物實驗中心），DMEM培養基，胎牛血清（Hyclone），四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Sigma），攜人VEGF腺病毒載體，0.25%胰蛋白酶（華美公司），0.02%乙二胺四乙酸（EDTA），ELISA試劑盒（博士德），jet-PEI細胞轉染試劑盒（晶美），5-溴脫氧尿嘧啶（BrdU，博士德）

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠骨髓間充質干細胞的培養處死大鼠，無菌條件下獲取大鼠股骨和脛骨，使用DMEM培養基沖洗骨髓腔，將沖洗后的懸液直接接種在DMEM培養基中（含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素），置于37℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養。24 h和72 h各換液1次，去除非貼壁細胞，以后每3天換液1次。當細胞生長達到80%～90%融合時，用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化，以1∶3傳代擴增培養，到第3代時細胞可用于以后的實驗。

1.2.2 將攜人VEGF腺病毒載體轉染骨髓間充質干細胞將大鼠第三代骨髓間充質干細胞接種至12孔培養板，培養至90%融合時，棄去培養上清。按jet-PEI試劑盒說明書操作步驟對其進行轉染。

1.2.3 骨髓間充質干細胞的標記BrdU-可代替胸腺嘧啶在DNA合成的S期，活體注射或細胞培養加入，然后利用抗BrdU單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細胞[5]。將轉染的骨髓間充質干細胞或骨髓間充質干細胞以3 μmol/L的BrdU培養24 h后換液，繼續培養24 h，即可等待移植。

1.2.4 大鼠急性心肌缺血模型的建立選取40只健康成年SD大鼠，稱重后，使用3%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射，并固定于手術板上，行氣管插管，呼吸機輔助呼吸。心前區備皮，常規消毒鋪單，在第3或第4肋間橫向切口開胸，切開心包。在動脈圓錐與左心耳之間冠狀動脈處結扎左冠狀動脈前降支。心電圖檢測ST段明顯抬高和（或）異常Q波出現表示建模成功。迅速縫合胸腔，待大鼠恢復自主呼吸后，停止人工輔助呼吸。術后應用青霉素3 d，400 000 U/d，繼續飼養。

1.2.5 細胞移植和實驗分組40只用于制作模型的大鼠有8只在＜6 h死亡，在大鼠心肌缺血模型成功建立1周后，隨機選擇30只大鼠，采用隨機分組法分為3組，每組10只。A組為聯合移植組：將VEGF轉染骨髓間充質干細胞（1×106）與無血清DMEM配置成200 μl，將大鼠暴露心臟，使用微量注射器經心外膜途徑在心肌梗死中央及外周移植細胞50 μl/點；B組為單純干細胞移植組：使用同等量的骨髓間充質干細胞與DMEM制成細胞懸液，采用同等方法注入大鼠心肌；C組為對照組：使用等量DMEM培養液，采用A組和B組的方法注入大鼠心肌。

1.3 檢測方法

1.3.1 超聲心動圖檢查模型建立后，在細胞移植前和細胞移植后第3周分別采用超聲心動圖檢測射血分數（EF），每只測量3個心動周期，取平均值。

1.3.2 免疫組織化學檢查細胞移植后第4周處死大鼠，制作心肌細胞連續切片，并進行HE常規染色和BrdU染色，確定心肌細胞的存活與分化。

1.3.3 新生毛細血管密度計數在200倍光學顯微鏡下觀察并統計毛細血管數量，每張切片隨機取4個視野，取其平均數。

1.4 統計學處理

采用SPSS 10.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以x±s表示，組間比較采用F檢驗，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠細胞移植前后EF的比較

細胞移植后3周，A組的EF高于B組和C組，B組的EF高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 3組大鼠細胞移植前后EF的比較（%，x±s）

與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

2.2 3組大鼠細胞移植后4周BrdU細胞個數的比較

細胞移植后4周，A組的BrdU細胞個數多于B組和C組，B組的BrdU細胞個數多于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。細胞移植后4周，A組和B組大鼠的梗死心肌均可以找到BrdU陽性移植細胞，C組則無（圖1）。

表2 3組大鼠細胞移植后4周BrdU細胞個數的比較

（個/高倍視野，x±s）

與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

圖1 3組大鼠BrdU染色結果（×200）

2.3 3組大鼠細胞移植后4周新生血管計數的比較

細胞移植后4周，A組的新生血管計數多于B組和C組，B組的新生血管計數多于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表3）。細胞移植后4周，3組心肌細胞梗死區域均可見新生毛細血管影（圖2）。

表3 3組大鼠細胞移植后4周新生血管計數的比較

（個/高倍視野，x±s）

與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

圖1 3組大鼠HE染色結果（×200）

3 討論

本實驗結果顯示，基因修飾骨髓間充質干細胞移植比單純骨髓間充質干細胞移植的效果更明顯，說明VEGF與骨髓間充質干細胞具有協同治療心肌梗死的作用，原因可能是VEGF轉染骨髓間充質干細胞后移植到梗死區域，使新生血管數目增加更多；骨髓間充質干細胞能向內皮細胞分化，參與移植后血管生成，并分泌VEGF[6-7]。心肌干細胞移植及聯合移植是一個新興的研究領域，移植細胞的活力受到心肌梗死多種不利因素的影響，包括：凋亡、缺少營養、缺血、宿主的相關因子、炎癥和免疫應答等[8]。目前仍有許多問題尚待解決，如選擇對人體無損害又便于追蹤的標志物；移植的最佳途徑、最佳時機、細胞數量尚不明確（劑量過大可產生較多不良反應）[9]；細胞移植后能否在宿主體內長期存活并正常增殖、分化等。同時基因修飾干細胞的移植過程很復雜，在將來工作中開展一種簡單的過程替代骨髓間充質干細胞的分離、轉染和外科注射的常規操作很有必要。

綜上所述，VEGF基因轉染骨髓間充質干細胞移植比單純骨髓間充質干細胞移植對心肌梗死的綜合療效好。

[參考文獻]

[1]Laflamme MA，Murry CE.Regenerating the heart[J].Nat Bio- technol，2005，23（7）：845-856.

[2]Toma C，Pittenger MF，Cahill KS，et al.Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotyoe in the adult murine heart[J].Circulation，2002，105（1）：93-98.

[3]Mosca JD，Hendricks JK，Buyaner D，et al.Mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery[J].Clin Orthop Realt Res，2000，（379 Suppl）：S71-S90.

[4]Vale PR，Losordo DW，Milliken CE，et al.Left ventricular electromechanical mapping to assess efficacy of phVEGF(165)gene transfer for therapeutic angiogenesis in chronic myocardial ischemia[J].Circulation，2000，102（9）：965-974.

[5]解慧琪，楊志明，魏人前.PtsA58H質粒轉化人胚腱細胞的生物學特性研究[J].中華手外科雜志，2000，16（3）：136-139.

[6]Rüster B，Gottig S，Ludwig RJ，et al.Mesenchymal stem cells display coordinated rolling and adhesion behavior on endothelial cells[J].Blood，2006，108（12）：3938-3944.

[7]McGonagle D，De Bari C，Arnold P，et al.Lessons from musculoskeletal stem cell research:the key to successful regenerative medicine development[J].Arthritis Rheum，2007，56（3）：714-721.

[8]Tran N，Li Y，Maskali F，et al.Short-term heart retention and distribution of intramyocardial delivered mesenchymal cells within necrotic or intact myocardium[J].Cell Transplant，2006， 15（4）：351-358.

[9]盛小剛，宋卉，馮建章，等.轉染人血管內皮生長因子165基因的骨髓間充質干細胞移植改善兔心肌梗死后心功能[J].中國動脈硬化雜志，2006，14（8）：669-672.

（收稿日期：2014-01-20本文編輯：李亞聰）

1.2.5 細胞移植和實驗分組40只用于制作模型的大鼠有8只在＜6 h死亡，在大鼠心肌缺血模型成功建立1周后，隨機選擇30只大鼠，采用隨機分組法分為3組，每組10只。A組為聯合移植組：將VEGF轉染骨髓間充質干細胞（1×106）與無血清DMEM配置成200 μl，將大鼠暴露心臟，使用微量注射器經心外膜途徑在心肌梗死中央及外周移植細胞50 μl/點；B組為單純干細胞移植組：使用同等量的骨髓間充質干細胞與DMEM制成細胞懸液，采用同等方法注入大鼠心肌；C組為對照組：使用等量DMEM培養液，采用A組和B組的方法注入大鼠心肌。

1.3 檢測方法

1.3.1 超聲心動圖檢查模型建立后，在細胞移植前和細胞移植后第3周分別采用超聲心動圖檢測射血分數（EF），每只測量3個心動周期，取平均值。

1.3.2 免疫組織化學檢查細胞移植后第4周處死大鼠，制作心肌細胞連續切片，并進行HE常規染色和BrdU染色，確定心肌細胞的存活與分化。

1.3.3 新生毛細血管密度計數在200倍光學顯微鏡下觀察并統計毛細血管數量，每張切片隨機取4個視野，取其平均數。

1.4 統計學處理

采用SPSS 10.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以x±s表示，組間比較采用F檢驗，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠細胞移植前后EF的比較

細胞移植后3周，A組的EF高于B組和C組，B組的EF高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 3組大鼠細胞移植前后EF的比較（%，x±s）

與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

2.2 3組大鼠細胞移植后4周BrdU細胞個數的比較

細胞移植后4周，A組的BrdU細胞個數多于B組和C組，B組的BrdU細胞個數多于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。細胞移植后4周，A組和B組大鼠的梗死心肌均可以找到BrdU陽性移植細胞，C組則無（圖1）。

表2 3組大鼠細胞移植后4周BrdU細胞個數的比較

（個/高倍視野，x±s）

與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

圖1 3組大鼠BrdU染色結果（×200）

2.3 3組大鼠細胞移植后4周新生血管計數的比較

細胞移植后4周，A組的新生血管計數多于B組和C組，B組的新生血管計數多于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表3）。細胞移植后4周，3組心肌細胞梗死區域均可見新生毛細血管影（圖2）。

表3 3組大鼠細胞移植后4周新生血管計數的比較

（個/高倍視野，x±s）

與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

圖1 3組大鼠HE染色結果（×200）

3 討論

本實驗結果顯示，基因修飾骨髓間充質干細胞移植比單純骨髓間充質干細胞移植的效果更明顯，說明VEGF與骨髓間充質干細胞具有協同治療心肌梗死的作用，原因可能是VEGF轉染骨髓間充質干細胞后移植到梗死區域，使新生血管數目增加更多；骨髓間充質干細胞能向內皮細胞分化，參與移植后血管生成，并分泌VEGF[6-7]。心肌干細胞移植及聯合移植是一個新興的研究領域，移植細胞的活力受到心肌梗死多種不利因素的影響，包括：凋亡、缺少營養、缺血、宿主的相關因子、炎癥和免疫應答等[8]。目前仍有許多問題尚待解決，如選擇對人體無損害又便于追蹤的標志物；移植的最佳途徑、最佳時機、細胞數量尚不明確（劑量過大可產生較多不良反應）[9]；細胞移植后能否在宿主體內長期存活并正常增殖、分化等。同時基因修飾干細胞的移植過程很復雜，在將來工作中開展一種簡單的過程替代骨髓間充質干細胞的分離、轉染和外科注射的常規操作很有必要。

綜上所述，VEGF基因轉染骨髓間充質干細胞移植比單純骨髓間充質干細胞移植對心肌梗死的綜合療效好。

[參考文獻]

[1]Laflamme MA，Murry CE.Regenerating the heart[J].Nat Bio- technol，2005，23（7）：845-856.

[2]Toma C，Pittenger MF，Cahill KS，et al.Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotyoe in the adult murine heart[J].Circulation，2002，105（1）：93-98.

[3]Mosca JD，Hendricks JK，Buyaner D，et al.Mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery[J].Clin Orthop Realt Res，2000，（379 Suppl）：S71-S90.

[4]Vale PR，Losordo DW，Milliken CE，et al.Left ventricular electromechanical mapping to assess efficacy of phVEGF(165)gene transfer for therapeutic angiogenesis in chronic myocardial ischemia[J].Circulation，2000，102（9）：965-974.

[5]解慧琪，楊志明，魏人前.PtsA58H質粒轉化人胚腱細胞的生物學特性研究[J].中華手外科雜志，2000，16（3）：136-139.

[6]Rüster B，Gottig S，Ludwig RJ，et al.Mesenchymal stem cells display coordinated rolling and adhesion behavior on endothelial cells[J].Blood，2006，108（12）：3938-3944.

[7]McGonagle D，De Bari C，Arnold P，et al.Lessons from musculoskeletal stem cell research:the key to successful regenerative medicine development[J].Arthritis Rheum，2007，56（3）：714-721.

[8]Tran N，Li Y，Maskali F，et al.Short-term heart retention and distribution of intramyocardial delivered mesenchymal cells within necrotic or intact myocardium[J].Cell Transplant，2006， 15（4）：351-358.

[9]盛小剛，宋卉，馮建章，等.轉染人血管內皮生長因子165基因的骨髓間充質干細胞移植改善兔心肌梗死后心功能[J].中國動脈硬化雜志，2006，14（8）：669-672.

（收稿日期：2014-01-20本文編輯：李亞聰）

1.2.5 細胞移植和實驗分組40只用于制作模型的大鼠有8只在＜6 h死亡，在大鼠心肌缺血模型成功建立1周后，隨機選擇30只大鼠，采用隨機分組法分為3組，每組10只。A組為聯合移植組：將VEGF轉染骨髓間充質干細胞（1×106）與無血清DMEM配置成200 μl，將大鼠暴露心臟，使用微量注射器經心外膜途徑在心肌梗死中央及外周移植細胞50 μl/點；B組為單純干細胞移植組：使用同等量的骨髓間充質干細胞與DMEM制成細胞懸液，采用同等方法注入大鼠心肌；C組為對照組：使用等量DMEM培養液，采用A組和B組的方法注入大鼠心肌。

1.3 檢測方法

1.3.1 超聲心動圖檢查模型建立后，在細胞移植前和細胞移植后第3周分別采用超聲心動圖檢測射血分數（EF），每只測量3個心動周期，取平均值。

1.3.2 免疫組織化學檢查細胞移植后第4周處死大鼠，制作心肌細胞連續切片，并進行HE常規染色和BrdU染色，確定心肌細胞的存活與分化。

1.3.3 新生毛細血管密度計數在200倍光學顯微鏡下觀察并統計毛細血管數量，每張切片隨機取4個視野，取其平均數。

1.4 統計學處理

采用SPSS 10.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以x±s表示，組間比較采用F檢驗，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠細胞移植前后EF的比較

細胞移植后3周，A組的EF高于B組和C組，B組的EF高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 3組大鼠細胞移植前后EF的比較（%，x±s）

與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

2.2 3組大鼠細胞移植后4周BrdU細胞個數的比較

細胞移植后4周，A組的BrdU細胞個數多于B組和C組，B組的BrdU細胞個數多于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。細胞移植后4周，A組和B組大鼠的梗死心肌均可以找到BrdU陽性移植細胞，C組則無（圖1）。

表2 3組大鼠細胞移植后4周BrdU細胞個數的比較

（個/高倍視野，x±s）

與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

圖1 3組大鼠BrdU染色結果（×200）

2.3 3組大鼠細胞移植后4周新生血管計數的比較

細胞移植后4周，A組的新生血管計數多于B組和C組，B組的新生血管計數多于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表3）。細胞移植后4周，3組心肌細胞梗死區域均可見新生毛細血管影（圖2）。

表3 3組大鼠細胞移植后4周新生血管計數的比較

（個/高倍視野，x±s）

與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

圖1 3組大鼠HE染色結果（×200）

3 討論

本實驗結果顯示，基因修飾骨髓間充質干細胞移植比單純骨髓間充質干細胞移植的效果更明顯，說明VEGF與骨髓間充質干細胞具有協同治療心肌梗死的作用，原因可能是VEGF轉染骨髓間充質干細胞后移植到梗死區域，使新生血管數目增加更多；骨髓間充質干細胞能向內皮細胞分化，參與移植后血管生成，并分泌VEGF[6-7]。心肌干細胞移植及聯合移植是一個新興的研究領域，移植細胞的活力受到心肌梗死多種不利因素的影響，包括：凋亡、缺少營養、缺血、宿主的相關因子、炎癥和免疫應答等[8]。目前仍有許多問題尚待解決，如選擇對人體無損害又便于追蹤的標志物；移植的最佳途徑、最佳時機、細胞數量尚不明確（劑量過大可產生較多不良反應）[9]；細胞移植后能否在宿主體內長期存活并正常增殖、分化等。同時基因修飾干細胞的移植過程很復雜，在將來工作中開展一種簡單的過程替代骨髓間充質干細胞的分離、轉染和外科注射的常規操作很有必要。

綜上所述，VEGF基因轉染骨髓間充質干細胞移植比單純骨髓間充質干細胞移植對心肌梗死的綜合療效好。

[參考文獻]

[1]Laflamme MA，Murry CE.Regenerating the heart[J].Nat Bio- technol，2005，23（7）：845-856.

[2]Toma C，Pittenger MF，Cahill KS，et al.Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotyoe in the adult murine heart[J].Circulation，2002，105（1）：93-98.

[3]Mosca JD，Hendricks JK，Buyaner D，et al.Mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery[J].Clin Orthop Realt Res，2000，（379 Suppl）：S71-S90.

[4]Vale PR，Losordo DW，Milliken CE，et al.Left ventricular electromechanical mapping to assess efficacy of phVEGF(165)gene transfer for therapeutic angiogenesis in chronic myocardial ischemia[J].Circulation，2000，102（9）：965-974.

[5]解慧琪，楊志明，魏人前.PtsA58H質粒轉化人胚腱細胞的生物學特性研究[J].中華手外科雜志，2000，16（3）：136-139.

[6]Rüster B，Gottig S，Ludwig RJ，et al.Mesenchymal stem cells display coordinated rolling and adhesion behavior on endothelial cells[J].Blood，2006，108（12）：3938-3944.

[7]McGonagle D，De Bari C，Arnold P，et al.Lessons from musculoskeletal stem cell research:the key to successful regenerative medicine development[J].Arthritis Rheum，2007，56（3）：714-721.

[8]Tran N，Li Y，Maskali F，et al.Short-term heart retention and distribution of intramyocardial delivered mesenchymal cells within necrotic or intact myocardium[J].Cell Transplant，2006， 15（4）：351-358.

[9]盛小剛，宋卉，馮建章，等.轉染人血管內皮生長因子165基因的骨髓間充質干細胞移植改善兔心肌梗死后心功能[J].中國動脈硬化雜志，2006，14（8）：669-672.

（收稿日期：2014-01-20本文編輯：李亞聰）