溫度對獼猴桃花青素含量及其合成基因AdAＮS的影響

李文彬+劉義飛+彭明+

摘要：為明確‘紅陽獼猴桃果肉中花青素含量在季節(jié)性溫度下的合成變化情況及花青素合成酶基因ＡｄＡＮＳ表達(dá)的變化，以‘紅陽主產(chǎn)區(qū)四川蒲江和湖北武漢的‘紅陽獼猴桃為研究對象，測定其花青素的含量并克隆花青素合成基因ＡｄＡＮＳ，并對其轉(zhuǎn)錄水平變化進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，較高的季節(jié)性溫度對果肉花青素的含量有抑制作用，在溫度適宜的蒲江，ＡｄＡＮＳ基因的表達(dá)水平與花青素積累變化相一致，而在高溫的武漢其表達(dá)水平受到明顯的抑制。

關(guān)鍵詞：‘紅陽獼猴桃；花青素；溫度波動；ＡｄＡＮＳ基因

中圖分類號：Ｓ６６３．４文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）09－2070-05

Effects of Temperature on Anthocyanin Content and Anthocyanin Synthase (AdANS)

of ‘Hongyang Kiwifruit

LI Wen-bin1,2,3,LIU Yi-fei4,PENG Ming1

(1.Institute of Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China;

2.Key Laboratory of Plant Germplasm Enhancement and Specialty Agriculture, Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Scienes, Wuhan 430074, China; 3.University of Chinese of Academy of Sciences, Beijing 100039, China; 4.Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Sustainable Utilization, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ：To illustrate the changes of anthocyanin concentration and anthocyanin synthase under seasonal fluctuated temperature, the concentration of anthocyanin of ‘Hongyang kiwifruit from Pujiang, Sichuan and Wuhan, Hubei was measured under different seasonal temperatures. Anthocyanin synthase (AdANS) was cloned. Quantitative real time PCR (RT-PCR) was used to detect the expression of AdANS during fruit development. Result showed that seasonal high temperature had negative regulation on anthocyanin concentration in flesh. The expression level of AdANS was positively cor related with anthocyanin synthesis in Pujiang with suitable temperature and was inhibited greatly in Wuhan with high temperature.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ‘Hongyang kiwifruit; anthocyanin; temperature fluctuation; AdANS

獼猴桃（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｐｌａｎｃｈ）馴化栽培至今已有１００余年的歷史［１］，因其具有獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)而受到廣大消費(fèi)者的喜愛。尤其是‘紅陽獼猴桃以其果實(shí)中心有放射狀紅色條紋，富含花青素而成為近年來消費(fèi)者的新寵。但該品種不耐夏季高溫干旱，特別是果肉紅色易受夏季溫度和濕度的影響，田間觀察發(fā)現(xiàn)，在夏季溫度較高的武漢種植的‘紅陽獼猴桃果肉的顏色非常淡，嚴(yán)重影響果實(shí)的商品價值［２］。

溫度是影響植物組織中花青素積累的一個非常重要的環(huán)境因子，研究表明低溫會誘導(dǎo)花青素的合成，而高溫（３０～４０ ℃）下果實(shí)中的花青素很難形成［３，４］。溫度對花青素合成的影響發(fā)生在其合成途徑的多步反應(yīng)中，在上游途徑中，溫度主要對苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）、查耳酮合成酶（ＣＨＳ）、查耳酮異構(gòu)酶（ＣＨＩ）和黃烷酮-３－羥化酶（Ｆ３Ｈ）等的基因進(jìn)行調(diào)控，而對下游的調(diào)控主要通過對二氫黃酮還原酶（ＤＦＲ）、花青素合成酶（ＡＮＳ）和類黃酮糖苷轉(zhuǎn)移酶（ＵＦＧＴ）等的基因進(jìn)行調(diào)控［５］。然而，目前為止，在‘紅陽獼猴桃果實(shí)發(fā)育期間，即季節(jié)性溫度變化下果實(shí)中花青素含量的變化及與花青素合成基因的關(guān)系還未見報道。為此，試驗(yàn)對四川（‘紅陽主產(chǎn)區(qū)）和武漢‘紅陽獼猴桃果實(shí)發(fā)育期間花青素含量及花青素合成酶基因（ＡｄＡＮＳ）的變化情況進(jìn)行研究，以期為溫度對花青素含量的影響及為提高‘紅陽獼猴桃果肉的花青素含量提供科學(xué)依據(jù)。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料為２０１２年四川蒲江（中興農(nóng)業(yè)科技有限公司提供）和湖北武漢（武漢植物園獼猴桃園）種植的有相同遺傳背景的‘紅陽獼猴桃植株，各３株。從坐果到果實(shí)收獲整個果實(shí)發(fā)育期均不施用任何植物激素及肥料。

每次每株取３個果實(shí)取樣后用冰浴保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室，取有花青素積累的靠近種子的果肉，在液氮中速凍，－７０ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１．２試驗(yàn)方法

１．２．１‘紅陽獼猴桃發(fā)育過程中溫度的測定以當(dāng)?shù)貧庀缶痔峁┑漠?dāng)日天氣條件為準(zhǔn)，分別記錄武漢及四川蒲江‘紅陽獼猴桃種植區(qū)從花后6０ ｄ到成熟收獲（花后１３６ ｄ）的日最高和最低溫度，考察‘紅陽獼猴桃生長期間溫度的變化。

１．２．２‘紅陽獼猴桃果肉花青素的提取及測定果肉在液氮中研磨至粉末，然后用５倍體積的甲醇／水／乙酸（體積比８０∶２０∶１）提取，以錫箔紙包裹遮光，在搖床中２８ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ提取３０ ｍｉｎ，于４ ℃冰箱中放置２４ ｈ，以０．４５ μｍ的濾紙過濾留上清液，５０ ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮備用［６］。

以美國Ｗａｔｅｒｓ公司的Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５液相色譜儀進(jìn)行測定，Ｃ１８柱（Ｎｏｖａ－ｐａｋ）規(guī)格為１５０ ｍｍ×３．９ ｍｍ，顆粒度４ μｍ。流動相Ａ為１％的甲酸，Ｂ相為乙腈，流速０．８ ｍＬ／ｍｉｎ，５３０ ｎｍ處檢測。

花青素標(biāo)準(zhǔn)品為ｃｙａｎｉｄｉｎｇ ３－Ｏ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ ＵＳＡ，ＣＡＳ Ｎｏ．２７６６１－３６－５）和ｃｙａｎｉｄｉｎｇ ３－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（ＷＡＫＯ，Ｊａｐａｎ，ＣＡＳ Ｎｏ．７０８４－２４－４）。

１．２．３‘紅陽獼猴桃ＲＮＡ的提取及檢測采用改良的ＣＴＡＢ法提取ＲＮＡ［７］。試驗(yàn)所用到的研缽、研杵、鑷子、藥匙等均于１８０ ℃滅菌４ ｈ，離心管及槍頭均采用無ＲＮＡ和ＤＮＡ酶的一次性耗材。

ＲＮＡ提取后，以１％的瓊脂糖凝膠電泳對所提取的ＲＮＡ進(jìn)行完整性檢測，以Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００分光光度計(jì)檢測ＲＮＡ濃度及Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ。

１．２．４ＡｄＡＮＳ基因的克隆、驗(yàn)證及序列分析根據(jù)已有獼猴桃ＥＳＴ序列及獼猴桃基因組測序結(jié)果，以ｃＤＮＡ為模板克隆得到一個花青素合成基因ＡｄＡＮＳ，將ＰＣＲ產(chǎn)物純化回收后連接ｐＥＡＳＹ載體由北京全式金生物技術(shù)有限公司測序，與已報道的其他物種中的同源基因序列利用進(jìn)化樹分析軟件ＭＥＧＡ （Ｖ５．０２）進(jìn)行分析。

根據(jù)ｃＤＮＡ序列設(shè)計(jì)特異性引物，將每個果實(shí)單獨(dú)提取ＲＮＡ后再等量混合，反轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ后進(jìn)行ＲＴ－ＰＣＲ。

實(shí)時熒光定量ＰＣＲ條件：１．５ μｇ總ＲＮＡ以ＦａｓｔＱｕａｎｔ ＲＴ ｋｉｔ（ｗｉｔｈ ｇＤＮａｓｅ）（ＴＩＡＮＧＥＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ） （北京）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈ｃＤＮＡ。１ μＬ ｃＤＮＡ模板，１０ μＬ ＳＹＢＲ?誖 Ｐｒｅｍｉｘ ＥｘＴａｑＴＭ （ＤＲＲ０４１Ａ，Ｔａｋ

ａｒａ），０．２ μｍｏｌ／Ｌ正反向引物，ＲＴ－ＰＣＲ在Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）儀上進(jìn)行，每個基因３次重復(fù)，以基因ＡｄＡｃｔｉｎ（ＧＩ∶１４９９３８９６３）在７０ＤＡＡ處的值作為標(biāo)準(zhǔn)。

擴(kuò)增程序?yàn)椋梗?℃ ３０ ｓ；９５ ℃ ５ ｓ，５５～６０ ℃２０ ｓ，４０ 個循環(huán)；７２ ℃ ２０ ｓ。溶解曲線程序?yàn)椋梗?℃１５ ｓ，５５～９５ ℃在１ ｍｉｎ內(nèi)以０．３ ℃遞增，再９５ ℃１５ ｓ。

２結(jié)果與分析

２．１‘紅陽獼猴桃生長期間四川蒲江和湖北武漢的溫度變化

在整個獼猴桃果實(shí)發(fā)育期，四川蒲江與湖北武漢溫度測定結(jié)果（圖１）顯示，花后６０～１３６ ｄ，武漢日最高溫平均為３３ ℃，而四川蒲江為２９ ℃；溫度高于３４ ℃的累積天數(shù)武漢為２７ ｄ，而蒲江只有９ ｄ。在武漢日最高溫平均高于３４ ℃的生長階段有三段，第一階段為花后６７～７２ ｄ，日最高溫平均３４．５ ℃；第二階段為花后８８～９９ ｄ，其中有５ d（95～９９ ｄ）連續(xù)溫度高于３６ ℃；第三階段為花后１１４～１18 ｄ，日最高溫平均為３５．２ ℃，而蒲江只在花后１０２～１０４ ｄ出現(xiàn)了３ ｄ的高溫（＞３５ ℃）。

２．２‘紅陽獼猴桃果實(shí)發(fā)育期間花青素變化趨勢

在溫度適宜的四川蒲江，‘紅陽獼猴桃果實(shí)花青素的變化（圖２）顯示，果實(shí)剛開始形成時子房中有紅色，而后經(jīng)歷了消失—開始累積—高峰—部分降解的變化過程。花后３０～６０ ｄ，原來子房中的花青素全部消失退凈，直到花后６０ ｄ在果實(shí)中隱約出現(xiàn)紅色絲狀花青素的累積，而后花青素積累呈增加趨勢，到花后１００ ｄ果實(shí)中花青素的濃度達(dá)到最高，為５６．９ μｇ／ｇ（以鮮重計(jì)，下同），此后，花青素的含量呈下降趨勢。而湖北武漢‘紅陽獼猴桃果實(shí)中花青素的含量只是在剛剛坐果時比較高，發(fā)育后期花青素含量不太高且沒有明顯的積累期，這可能與其生長期間的３次高溫有關(guān)，最終花青素含量（５．９ μｇ／ｇ）只有蒲江花青素含量（３１．３ μｇ／ｇ）的１／５不到， 表明花青素含量可能對溫度的變化比較敏感。

２．３ＲＮＡ質(zhì)量及濃度檢測

以１％的瓊脂糖凝膠電泳對所提取的ＲＮＡ進(jìn)行完整性檢測（圖３），發(fā)現(xiàn)提取的總ＲＮＡ均呈現(xiàn)兩條清晰、無明顯拖尾現(xiàn)象的條帶，說明獲得的總ＲＮＡ樣品完整性較好。

其中ＲＮＡ濃度都比較高，且其吸光度要求達(dá)到：１．８≤Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ≤２．２，Ａ２６０ｎｍ／Ａ２３０ｎｍ≥１．８（表１）。高質(zhì)量的ＲＮＡ為下一步ｃＤＮＡ反轉(zhuǎn)錄、基因克隆及實(shí)時熒光定量ＰＣＲ提供了保證。

２．４基因克隆及測序結(jié)果

ＡｄＡＮＳ基因的ｃＤＮＡ序列全長為１ ２２０ ｂｐ（圖４）， 其開放閱讀框?yàn)椋?０６８ ｂｐ （１４２～１ ２０９ ｂｐ），５′端非編碼區(qū)為１４１ ｂｐ，編碼一個由３５５個氨基酸組成的多肽（圖５），利用ＭＥＧＡ軟件，將‘紅陽AdＡＮＳ編碼的氨基酸序列與已發(fā)表的模式植物擬南芥、葡萄等的氨基酸全長序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與紅山茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｃｈｅｋｉａｎｇｏｌｅｏｓａ）和葡萄（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）中的ＡＮＳ進(jìn)化關(guān)系最近，氨基酸序列相似性最高（圖６）。

２．５ＡｄＡＮＳ在‘紅陽果實(shí)發(fā)育期間的表達(dá)模式

以ＡｄＡＮＳ的５′端設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量ＰＣＲ，序列特異性引物如下：

Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５′→３′）：ＡＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＣＡ

ＧＴＧＧＴＣＧＧＡＡ

Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（５′→３′）：ＧＧＧＣＣＡＴＴＣＴＣＣＴＴＣ

ＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴ

獼猴桃AdＡｃｔｉｎ（ＧＩ：１４９９３８９６３）基因序列特異性引物如下：

Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５′→３′）：ＴＧＡＧＡＧＡＴＴＣＣＧＴＴ

ＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴ

Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（５′→３′）：ＴＴＣＣＴＴＡＣＴＣＡＴＧＣＧＧＴＣＴＧＣＧＡＴ）

實(shí)時熒光定量ＰＣＲ結(jié)果表明（圖７），AdＡＮＳ基因擴(kuò)增曲線的Ｃｔ值為２２～２６，而溶解曲線呈現(xiàn)單峰,表明擴(kuò)增的特異性好。從圖８可以看出，在蒲江7０～10０ ｄ，ＡｄＡＮＳ的表達(dá)量增加了9倍左右，而后表達(dá)量逐漸降低，但是花青素的凈積累仍在增加，花后１1０ ｄ花青素的凈積累停止。花青素的凈積累停止后可能又有降解發(fā)生，可能和溫度及果實(shí)發(fā)育均有關(guān)。ＡｄＡＮＳ隨后也保持較低的水平。而在武漢，總體來說與花青素積累量變化較小，與其相一致的是ＡｄＡＮＳ的表達(dá)水平變化也非常小（小于１．５倍）。花后110 ｄ時，ＡｄＡＮＳ的表達(dá)是花后１００ ｄ時的１．４倍，而后迅速下降，花后９０～１１０ ｄ，ＡｄＡＮＳ的表達(dá)趨勢與花青素積累增加變化趨勢相一致。而１１０～１３６ ｄ，花青素的積累量呈先減少再小幅增加的趨勢，而ＡｄＡＮＳ的表達(dá)也與花青素的積累變化相一致，先減小后增加。結(jié)果表明，無論在何種溫度狀態(tài)下，花青素合成基因ＡｄＡＮＳ的表達(dá)變化都與花青素的積累變化相一致。

３小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，‘紅陽獼猴桃果肉中花青素的含量在不同的季節(jié)性溫度下呈現(xiàn)出明顯的不同，尤其在季節(jié)性高溫條件下，花青素的含量非常低，表明可能花青素的合成受到溫度的強(qiáng)烈調(diào)控，尤其當(dāng)蒲江在花后１０２～１０４ ｄ出現(xiàn)了３ ｄ的高溫（＞３５ ℃）后，花青素的積累也從花后１００ ｄ的最高含量５６．９ μｇ／ｇ開始下降。花青素的合成尤其是花青素合成中的關(guān)鍵酶花青素合成酶受花青素合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的直接調(diào)控［８］，研究結(jié)果也表明，在溫度適宜的蒲江，花青素合成基因ＡｄＡＮＳ的表達(dá)趨勢與果肉中花青素的積累規(guī)律相一致，即在花青素積累速度最快的花后９０～１００ ｄ，ＡｄＡＮＳ表達(dá)水平的變化也最大。而在整個發(fā)育期間溫度都較高的武漢，雖然ＡｄＡＮＳ的轉(zhuǎn)錄水平變化比較小，但是其表達(dá)水平的變化與花青素的積累變化規(guī)律相一致。研究結(jié)果也表明ＡｄＡＮＳ較低的表達(dá)水平可能與武漢的高溫密切相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致花青素的合成下降，果實(shí)花青素的含量降低。

花青素含量是果實(shí)品質(zhì)的一個重要方面，因此也是許多遺傳育種工作的重點(diǎn)。果肉中花青素的形成是由遺傳、發(fā)育和環(huán)境共同調(diào)控的復(fù)雜的代謝過程［９］。在許多果實(shí)中，當(dāng)果實(shí)成熟時類黃酮途徑中原本產(chǎn)生原花青素和黃酮醇的途徑會轉(zhuǎn)為花青素的合成。但是‘紅陽獼猴桃不是在果實(shí)成熟時才合成花青素，而是在果實(shí)發(fā)育中期就開始合成，一直保持到果實(shí)成熟，可能與果皮中花青素合成的機(jī)制不同。另外草莓中花青素的研究表明類黃酮的水平、相關(guān)基因的表達(dá)及酶的活性明顯受到果實(shí)發(fā)育的影響［１０］。‘紅陽獼猴桃中花青素的水平除受到類黃酮相關(guān)基因的調(diào)控外，環(huán)境因子也會通過調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄及相關(guān)酶的活性間接影響花青素的合成。

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花青素含量是果實(shí)品質(zhì)的一個重要方面，因此也是許多遺傳育種工作的重點(diǎn)。果肉中花青素的形成是由遺傳、發(fā)育和環(huán)境共同調(diào)控的復(fù)雜的代謝過程［９］。在許多果實(shí)中，當(dāng)果實(shí)成熟時類黃酮途徑中原本產(chǎn)生原花青素和黃酮醇的途徑會轉(zhuǎn)為花青素的合成。但是‘紅陽獼猴桃不是在果實(shí)成熟時才合成花青素，而是在果實(shí)發(fā)育中期就開始合成，一直保持到果實(shí)成熟，可能與果皮中花青素合成的機(jī)制不同。另外草莓中花青素的研究表明類黃酮的水平、相關(guān)基因的表達(dá)及酶的活性明顯受到果實(shí)發(fā)育的影響［１０］。‘紅陽獼猴桃中花青素的水平除受到類黃酮相關(guān)基因的調(diào)控外，環(huán)境因子也會通過調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄及相關(guān)酶的活性間接影響花青素的合成。

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花青素含量是果實(shí)品質(zhì)的一個重要方面，因此也是許多遺傳育種工作的重點(diǎn)。果肉中花青素的形成是由遺傳、發(fā)育和環(huán)境共同調(diào)控的復(fù)雜的代謝過程［９］。在許多果實(shí)中，當(dāng)果實(shí)成熟時類黃酮途徑中原本產(chǎn)生原花青素和黃酮醇的途徑會轉(zhuǎn)為花青素的合成。但是‘紅陽獼猴桃不是在果實(shí)成熟時才合成花青素，而是在果實(shí)發(fā)育中期就開始合成，一直保持到果實(shí)成熟，可能與果皮中花青素合成的機(jī)制不同。另外草莓中花青素的研究表明類黃酮的水平、相關(guān)基因的表達(dá)及酶的活性明顯受到果實(shí)發(fā)育的影響［１０］。‘紅陽獼猴桃中花青素的水平除受到類黃酮相關(guān)基因的調(diào)控外，環(huán)境因子也會通過調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄及相關(guān)酶的活性間接影響花青素的合成。

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［１０］ ＣＡＲＢＯＮＥ Ｆ， ＰＲＥＵＳＳ Ａ， Ｄ Ｅ ＶＯＳ Ｒ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ， ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｇｅｎｅｓ， ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｆｒｕｉｔｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ＆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２００９，３２：１１１７－１１３１．