內質網應激預處理對丙烯腈氧化性損傷的保護作用

方云濤，張盼盼，趙文君，王蘇華，邢光偉，馬靜，陸榮柱

（江蘇大學醫學院衛生檢驗系，江蘇鎮江212013）

內質網應激預處理對丙烯腈氧化性損傷的保護作用

方云濤，張盼盼，趙文君，王蘇華，邢光偉，馬靜，陸榮柱

（江蘇大學醫學院衛生檢驗系，江蘇鎮江212013）

目的：利用內質網應激誘導劑2-脫氧葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）預處理探究內質網應激對丙烯腈氧化性損傷的保護效應及其作用機制。方法：將36只SD雄性大鼠隨機分為6組，即空白組、2-DG組、50 mg／kg丙烯腈組、75 mg／kg丙烯腈組、2-DG＋50 mg／kg丙烯腈組、2-DG＋75 mg／kg丙烯腈組。采取腹腔注射的方式給予2-DG預處理和急性丙烯腈染毒，空白組注射生理鹽水。2-DG預處理為100 mg／kg每天定時腹腔注射1次，持續1周，隨后丙烯腈染毒；丙烯腈組腹腔注射丙烯腈（質量濃度為50、75 mg／kg）1 h后麻醉大鼠并斷頭處死，迅速在冰上分離腦和肝，利用蛋白印跡法檢測葡萄糖調節蛋白78（glucose-regulated protein，Grp78）的表達，同時測定肝臟和大腦中丙二醛、還原性谷胱甘肽（GSH）含量和SOD活性。結果：與空白組比較，2-DG對大鼠肝臟和大腦中Grp78的表達具有明顯的誘導作用（P＜0.05），丙烯腈染毒明顯增加大鼠肝臟和大腦中丙二醛含量（P＜0.05），但卻明顯降低GSH含量和SOD活性（P＜0.05）。經2-DG預處理后丙烯腈染毒大鼠肝、腦中的丙二醛含量增加幅度減小，且GSH含量和SOD活性的降低也有所緩解。結論：內質網應激誘導能拮抗丙烯腈誘導的氧化性損傷。

內質網應激；2-脫氧葡萄糖；丙烯腈；葡萄糖調節蛋白78

丙烯腈是一種重要的有機化工原料，是生產腈綸纖維、塑料和樹脂等化工產品的重要原料［1］。但是丙烯腈也具有毒性，作用類似于氫氰酸，屬于高毒腈類有機化合物，會損害神經系統、消化系統與呼吸循環系統，并且具有致癌性［2－3］。內質網應激（endoplasmic reticulum stress）是指細胞內蛋白質加工運輸或鈣穩態失衡，生理功能紊亂的病理過程。當細胞穩態被破壞時，發生錯誤折疊的蛋白質在內質網中積累，鈣離子外流，蛋白質糖基化被抑制，蛋白質轉運被阻斷，誘發內質網應激［4］。適度的內質網應激是細胞為適應環境壓力而進行自我保護的重要手段。已有研究發現，適度上調內質網應激蛋白的表達能夠保護外源性化學物所致的神經、肝臟以及腎臟的損傷，因而誘導內質網應激可能成為保護內源性細胞的重要手段［5］。為此，在前期研究的基礎上，本研究采用2-脫氧葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）誘導內質網應激，并觀察這種預誘導對丙烯腈急性氧化性毒性的拮抗效應，為丙烯腈中毒的治療與預防提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

Bio-Rad垂直電泳系統、臺式冷凍離心機（美國Beckman公司）；722可見分光光度計（上海新茂儀器有限公司）；丙二醛試劑盒、還原性谷胱甘肽（GSH）試劑盒以及超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；總蛋白抽提試劑盒購于上?？党缮锕こ逃邢薰荆?-DG（美國Sigma公司），兔抗大鼠葡萄糖調節蛋白78（glucoseregulated protein，Grp78）抗體（美國Cell Signaling Technology公司），HRP標記羊抗兔二抗（美國Santa Cruz公司）。

1.2 實驗分組及處理

36只雄性SD大鼠，購自江蘇大學實驗動物中心，體質量180～220 g，分為空白組、2-DG組、50 mg／kg丙烯腈組，75 mg／kg丙烯腈組、2-DG＋50 mg／kg丙烯腈組，2-DG＋75 mg／kg丙烯腈組。

空白組：腹腔注射生理鹽水。2-DG組：按體質量腹腔注射2-DG（100 mg／kg），每24 h 1次，持續1周；最后一次給藥8 h后麻醉斷頭處死大鼠，迅速在冰上分離腦和肝儲存備用。丙烯腈組腹腔注射丙烯腈（質量濃度為50、75 mg／kg）并在1 h后麻醉斷頭處死，迅速在冰上分離腦和肝，儲存待用。2-DG＋丙烯腈組：每天腹腔注射2-DG 1次，持續給藥1周，最后一次給藥8 h后予丙烯腈染毒1 h。后續步驟同其他組。

1.3 內質網應激標志性蛋白Grp78的檢測

稱?。?0℃保存的肝、腦組織各100 mg，加入預冷組織蛋白裂解液（每1 mL蛋白質裂解液中加入5μL蛋白酶抑制劑，5μL PMSF和5μL磷酸酶），在組織勻漿器中研磨，勻漿均勻后轉移至1.5 mL離心管中，4℃，12 000×g離心15 min，取上清，轉移至新的離心管中，每管約200μL，取少量利用BCA試劑盒進行蛋白定量，隨后加入蛋白質電泳上樣緩沖液，煮沸10 min，儲存于－80℃備用。采用蛋白質印跡法檢測肝、腦組織中Grp78的表達情況。

1.4 大鼠大腦和肝臟中丙二醛含量的檢測

采用硫代巴比妥酸（TBA）法，取0.2 mL組織勻漿上清液，按照丙二醛測試盒說明書要求，加入試劑，快速混勻器混勻，95℃水浴60 min，流水冷卻，3 500 r／min離心10 min，取上清液，波長532 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調零，測定各管光密度值，通過標準計算公式求出TBA反應產物（TBARS）的含量。結果以組織勻漿液每mg蛋白中TBARS的nmol數表示。

1.5 大鼠大腦和肝臟中GSH含量的檢測

采用5-硫代2-硝基苯甲酸比色法（DTNB）檢測大鼠腦組織和肝組織GSH含量。在10%組織勻漿中，加入5%三氯乙酸，2 000 r／min離心20 min，取上清液。按照GSH試劑盒要求，加入試劑，快速混勻器混勻，在波長420 nm，1 cm光徑下，蒸餾水調零，測定各管光密度值，結果以每mg蛋白中GSH的nmol數表示。

1.6 檢測大鼠大腦和肝臟中的SOD活性

黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生的超氧陰離子自由基（O2－）可氧化羥胺形成亞硝酸鹽，后者在顯色劑作用下生成紫紅色的產物，樣品中含有的SOD對O2－有專一的抑制作用，從而使亞硝酸鹽的形成減少，通過測定樣品管與對照管的光密度值，計算被測樣品的SOD活性。在波長500 nm，1 cm光徑下檢測光密度值，結果以每mg蛋白的SOD活性為單位表示。實驗試劑及配制，操作步驟，以及實驗數據的處理方法參見南京建成科技有限公司生產的試劑盒說明書。

1.7 統計學分析

采用SPSS 14.0軟件進行統計分析，所有數據均采用均數±標準差表示，進行單因素方差分析及兩兩比較的q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2-DG誘導大鼠肝臟Grp78表達

蛋白質印跡結果顯示，2-DG誘導了大鼠體內內質網應激反應的發生（圖1，圖2）。在100 mg／kg 2-DG預處理時，大鼠肝臟區域Grp78的表達明顯上升（P＜0.05）。而大腦中Grp78的表達亦顯示上升趨勢，但與對照組比較，差異并無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 2-DG對丙烯腈染毒大鼠肝、腦組織丙二醛含量的影響

圖1 2-DG及不同劑量丙烯腈對大鼠肝臟Grp78表達的影響

圖2 2-DG及不同劑量丙烯腈對大鼠腦組織Grp78表達的影響

與空白組比較，丙烯腈染毒導致腦組織和肝組織中脂質過氧化產物丙二醛含量明顯升高（P＜0.05），以腦組織中增加更明顯（P＜0.05），并且隨著丙烯腈濃度的增大丙二醛含量也隨之增加。與相應的丙烯腈組比較，2-DG＋丙烯腈組的丙二醛含量均有所下降，但只有2-DG＋50mg／kg丙烯腈組差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 2-DG預處理對丙烯腈染毒大鼠腦和肝臟丙二醛含量的影響

2.3 2-DG預處理對丙烯腈染毒大鼠肝、腦組織GSH含量的影響

單獨2-DG處理肝和腦組織對GSH含量基本沒有影響，丙烯腈處理組肝組織和腦組織中GSH含量較空白組明顯下降（P＜0.05），且肝臟GSH下降較腦組織更明顯。2-DG＋50 mg／kg丙烯腈和2-DG＋75 mg／kg丙烯腈組腦組織中GSH含量較丙烯腈組明顯增加（P＜0.05），而肝組織中2-DG＋75 mg／kg丙烯腈組GSH含量的增加具有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

2.4 2-DG對丙烯腈染毒大鼠肝、腦中SOD活性的影響

與對照組比較，丙烯腈染毒組腦組織和肝組織中SOD活性有所下降。其中，75 mg／kg丙烯腈組SOD活性下降具有統計學意義（P＜0.05），50 mg／kg組的差異無統計學意義。與對應的丙烯腈組比較，2-DG＋50 mg／kg丙烯腈處理組和2-DG＋75 mg／kg丙烯腈處理組的SOD活性均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。

圖4 2-DG預處理對丙烯腈染毒大鼠腦和肝臟中GSH含量的影響

圖5 2-DG預處理對丙烯腈染毒大鼠腦和肝臟中SOD活性的影響

3 討論

丙烯腈的毒性主要與其在體內代謝產生的CN－有關，中毒癥狀與無機氰化物類似，主要作用于細胞線粒體呼吸鏈，CN－抑制細胞色素C氧化酶，中斷呼吸鏈中電子的傳遞，使生物氧化過程完全中止，誘發細胞內窒息導致細胞死亡［6－7］。

慢性丙烯腈中毒可出現頭痛，頭暈，乏力，失眠多夢等癥狀，還具有一定的致癌性［3］。長期的致癌實驗結果顯示，通過飲水、灌胃、吸入等方式進行染毒，均會誘導大鼠發生不同類型的腫瘤，神經膠質瘤與丙烯腈的相關性更為明顯［8－9］。作為一種劇毒性有機氰，丙烯腈的主要靶器官為中樞神經系統，急性丙烯腈中毒時，中樞神經系統最早出現癥狀，且癥狀最為突出。大鼠急性染毒主要表現為流涎、多汗等膽堿能神經興奮癥狀，隨后出現抽搐、呼吸衰竭，最終死亡［10］。丙烯腈急性中毒后也會引起人體肌力及肌張力減弱、感覺障礙、原始反射減退等周圍神經損害癥狀，還會導致消化系統和呼吸循環系統異常［11］。對職業人群進行的流行病學調查也證實丙烯腈可引起疲勞、記憶力減退等精神神經癥狀［12］。雖然對丙烯腈的毒性機制已經研究得越來越深入，但其確切機制仍未明了。有研究提示，缺氧、低糖、化學毒物等應激信號可使內質網內錯誤折疊蛋白增多，誘發未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）［13］。最近相繼有研究提示，激發細胞的內質網應激是提高細胞適應能力和進行細胞保護的重要手段，誘導內質網應激蛋白的表達能夠保護外源性化學物質所致的神經、肝臟以及腎臟的損傷［13］。這些結果提示內質網應激誘導可提高細胞活力，拮抗體內外有害因素的損害。

Grp78也稱為重鏈結合蛋白，是內質網功能的中心調節者。由于其在蛋白質折疊、聚集、促進非折疊蛋白降解、內質網Ca2＋調節和控制內質網跨膜感受器的激活等過程中具有重要作用，因此Grp78的誘導被廣泛用作內質網應激和UPR啟動的生物標記［12］。本研究結果顯示，大鼠腹腔注射2-DG可誘導腦、肝臟細胞的內質網應激，Grp78表達明顯增強可啟動UPR；UPR既是細胞抵抗應激保護自身，也是應激損傷細胞恢復自身功能的重要機制。本實驗通過動物模型進行2-DG預誘導來探討激活內質網應激通路對丙烯腈毒性的作用，結果證實內質網應激誘導劑2-DG誘導了大鼠肝臟和腦中內質網應激的發生，從而保護了丙烯腈誘導的氧化性損傷。

GSH是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的三肽，參與體內三羧酸循環及糖代謝，使人體獲得高能量［13］。作為細胞內一種重要的代謝調節物質，GSH能激活多種酶，從而促進糖類、脂肪及蛋白質代謝，并能影響細胞的代謝過程。GSH還能參與體內氧化還原過程，與過氧化物及自由基結合以對抗氧化劑對巰基的破壞，保護細胞膜中含巰基的蛋白質和含巰基酶不被破壞。因此，GSH也是機體內一種重要的非酶類抗氧化劑［14］。本實驗發現丙烯腈處理組腦組織GSH含量明顯下降，可能由于線粒體遭破壞，生成的GSH減少，或者是由于丙烯腈誘導產生過多的自由基導致GSH耗竭。本實驗結果顯示大鼠經丙烯腈急性染毒后，肝臟和腦組織中SOD活性明顯降低，丙二醛生成明顯增多，說明在本實驗條件下丙烯腈（50，75 mg／kg）會誘發神經細胞氧化應激損傷的產生。2-DG預處理上調內質網應激后可明顯抑制丙烯腈誘導的丙二醛含量的生成、GSH的消耗和SOD活性的降低，提示內質網應激具有拮抗丙烯腈氧化毒性的作用。無論在大鼠腦組織還是肝組織，2-DG都能減輕丙烯腈誘導的氧化性損傷，證實氧化應激是丙烯腈神經毒性的一個重要機制。本研究利用2-DG預處理證明其可通過誘導內質網應激反應減輕丙烯腈毒性，為丙烯腈中毒的防治提供了新的線索和救治途徑。

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Effects of endoplasm ic reticulum stress pretreatment on oxidative toxicity of acrylonitrile in rats

FANGYun-tao，ZHANGPan-pan，ZHAOWen-jun，WANGSu-hua，XINGGuang-wei，MA Jing，LU Rong-zhu
（Department of Public Health Laboratory Sciences，School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To explore the effects of pretreatment of endoplasmic reticulum stress on oxidative toxicity of acrylonitrile in rats.M ethods：Thirty-six SD rats were randomly divided into six groups as follows：blank control group，2-DG alone treated group，two acrylonitrile treated groups，2-DG pretreated and acrylonitrile treated groups.The animalswere intraperitoneally injected daily with 2-DG at the dosage of100 mg／kg for1 week，then ratswere intraperitoneally injected with acrylonitrile（50，75 mg／kg），and they were decapitated 1 h after the lastadministration of acrylonitrile or normal saline.The brain and liver tissueswere immediately dissected out and weighted on ice.The expression of glucose-regulated protein-78（Grp78）was determined by Western blotting.Oxidative toxicity of acrylonitrile was assessed by the reduced glutathione levels（GSH），products of lipid peroxidation（MDA），and superoxide dismutase（SOD）activity in the brain and liver.Results：Levels of protein expression of Grp78 increased after pretreatmentwith 2-DG compared with thatof control group（P＜0.05）.A significant increase in levels ofMDA was observed in the acrylonitrile-treated group both in the brain and liver compared with the control group（P＜0.05）.These increaseswere accompanied by a significant decrease in GSH contentand a significant reduction in SOD activity in the same tissues（P＜0.05）.However，when rats were pretreated with 2-DG，increase of MDA and decrease of GSH contents and SOD activity was significantly attenuated both in liver and brain，compared with acrylonitrile administration alone.Conclusion：Pretreatment with 2-DG reversed the acrylonitrile-induced effects by reducing the levels of MDA and enhancing SOD activity and increasing GSH content bothin the brain and liver.

endoplasmic reticulum stress；2-dexoxy-D-glucose；acrylonitrile；glucose-regulated protein 78

TQ086.5

A

1671－7783（2014）04－0302－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140112

國家自然科學基金資助項目（30872139；81273124）

方云濤（1988—），男，碩士研究生；陸榮柱（通訊作者），博士，教授，碩士生導師，E-mail：lurz＠mail.ujs.edu.cn

2014－04－29 ［編輯］陳海林