清腸溫中方對三硝基苯磺酸誘導的實驗性結腸炎大鼠腸黏膜作用的研究

劉麗娟 王允亮 史瑞 魏仕兵 楊美娟 李軍祥

·論著·

清腸溫中方對三硝基苯磺酸誘導的實驗性結腸炎大鼠腸黏膜作用的研究

劉麗娟 王允亮 史瑞 魏仕兵 楊美娟 李軍祥

目的研究清腸溫中方對三硝基苯磺酸誘導的實驗性結腸炎大鼠結腸黏膜的作用。方法以三硝基苯磺酸灌腸誘導大鼠急性結腸炎，造模成功后連續以清腸溫中方高、中、低劑量混懸液及柳氮磺吡啶(salazosulfapyridine，SASP)混懸液灌胃治療10天，取結腸，進行疾病活動指數(disease activity index, DAI)，結腸黏膜損傷指數(colonic mucosa damage index, CMDI)和結腸組織病理學(histological score, HS)評價。結果藥物干預10天后，模型組DAI、CMDI、HS明顯高于正常組(P<0.05)；SASP組DAI及CMDI均較模型組有明顯的下降(P<0.05)；清腸溫中方各劑量組DAI、CMDI、HS水平較模型組均明顯下降(P<0.05),其中清腸溫中方高、中劑量組炎細胞侵潤的程度明顯低于模型組(P<0.05)。結論清腸溫中方對三硝基苯磺酸誘導的結腸炎大鼠腸黏膜有保護作用，且能有效改善結腸組織炎細胞侵潤。

清腸溫中方; 疾病活動指數; 結腸黏膜損傷指數; 病理學評價; 炎性侵潤

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一組特發性、慢性、炎癥性腸道疾病狀態，包括克羅恩病(Crohn`s disease, CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)[1]。IBD過去常見于發達國家，近幾十年發展中國家的發病率逐步上升[2]。中醫藥對IBD的治療有著明顯的優勢[3]。清腸溫中方在臨床IBD的治療中有著顯著的療效，本研究擬在觀察清腸溫中方對2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-Benzenesulfonic acid, TNBS)誘導的實驗性結腸炎大鼠腸黏膜的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康雄性SD大鼠，46只，體重(200±20)g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK(京)2012-0001]，常規飼養于北京中醫藥大學SPF級動物房，12小時光照/黑夜循環，溫度(22±2)℃，濕度50～60%；自由飲食飲水飼養。

清腸溫中方配方顆粒(黃連9 g、炮姜9 g、三七6 g、木香6 g、炙甘草3 g等)購自北京中醫藥大學東方醫院配方顆粒藥房；柳氮磺吡啶片(SASP，上海中西三維藥業有限公司)購自北京中醫藥大學東方醫院藥房；TNBS，5%(w/v)購自sigma(P2297)，冰乙酸(NO.81601)、鄰甲聯苯胺(NO.61805)購自國藥集團化學試劑北京有限公司。

1.2 動物分組與造模

SD大鼠適應性飼養1周后，按隨機數字表隨機分為正常組(5只)、模型組(10只)、柳氮磺吡啶組(400 mg/kg，10只)、高劑量組(清腸溫中方生藥量1200 mg/kg，10只)、中劑量組(清腸溫中方生藥量600 mg/kg，10只)、低劑量組(清腸溫中方生藥量300 mg/kg，10只)。采用TNBS/乙醇復合法復制實驗性結腸炎大鼠模型[4]。造模前大鼠禁食不禁水24小時，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，將乳膠軟管液體石蠟潤滑后由肛門緩慢輕插入直腸約8 cm，一次性緩慢推注含33.3%乙醇的TNBS溶液(100 mg/kg)0.6 ml，1分鐘之內完成，保持仰臥位臀部向上15分鐘，空白組灌入等量去離子水，自然蘇醒后放回籠中，常規飼養。造模3天后隨即取5只大鼠處死后觀察結腸以確定造模成功。造模第4天連續給予相應藥物灌胃治療10天，模型組及正常組以去離子水對照，10 ml/kg，每天觀察大鼠一般狀況，稱取體重，檢測大便潛血，觀察大便一般性狀。以造模第一天為DAY1，灌胃結束為DAY13。

1.3 標本采集與處理

末次給藥后，禁食不禁水24小時準備結腸，10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，常溫放置3小時后離心分離血清(3000 rpm，10分鐘)，分裝后-20℃凍存備用；分離遠端結腸10 cm，沿腸系膜縱軸剪開腸腔，冰PBS沖洗后觀察結腸黏膜損傷情況；取結腸損傷明顯處1 cm×1 cm放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片4 μm，HE染色觀察病理。

1.4 疾病活動指數、結腸黏膜損傷指數

便潛血采用鄰甲聯苯胺法檢測[5]：取2～3滴0.15 L/L鄰甲聯苯胺冰乙酸溶液滴于糞便上，滴加3%過氧化氫2～3滴，立即觀察結果，在2分鐘內顯藍色為陽性。疾病活動指數(disease activity index，DAI)評分[6]：體質量：0分無下降，1分下降1%～5%，2分下降5%～10%，3分下降10%～15%，4分下降>15%；大便性狀：0分正常，2分松散，4分腹瀉；大便隱血：0分無，2分陽性，4分肉眼血便。DAI=(體質量下降分數+糞便性狀分數+隱血分數)/3。

結腸黏膜損傷指數(colonic mucosa damage index，CMDI)評分[7]：0分無損傷；1分無潰瘍；2分腸壁變厚，無潰瘍；3分有潰瘍，直徑<1 cm；4分有潰瘍，直徑>1 cm，腸管與周圍組織無粘連；5分有潰瘍，直徑>1 cm，腸管與周圍組織有粘連。CMDI、DAI評估均由非課題組成員完成。

1.5 結腸組織病理學評分

石蠟切片常規HE染色，封片。結腸組織病理學評分(histological score, HS)評分標準[8]：HE染色后光學顯微鏡下觀察評分，炎癥細胞浸潤(inflammatory infiltration, II)：0分無炎細胞侵潤，1分輕度，2分重度；肉芽腫：0分無，1分輕，2分重；病變深度：0分黏膜層，1分黏膜下層，2分肌層，3分漿膜層，計算總分，每個樣本隨機取3個視野，計算平均分。HS評估均由非課題組成員在病理老師指導下完成。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 一般情況及DAI

造模后第2天，模型組大鼠出現腹瀉，為黃色稀便、半稀便甚至血便。大鼠毛色失去光澤，活動性差，反應遲緩、懶動，至第3天DAI到最大。

第5天(總第7天，DAY7)各用藥組大鼠精神好轉，毛色漸有光澤，食欲增加，活動逐漸增多，大便逐漸正常，DAI明顯下降(P<0.05，非參數檢驗)，用藥第5天(總第7天，DAY7)到用藥10天(總第13天，DAY13)DAI的恢復較為緩慢，無明顯差別(P>0.05，非參數檢驗)。空白組大鼠則無上述精神、食欲、活動、毛色等情況，如表1。藥物干預10天后，模型組DAI仍明顯高于正常組(P=0.003<0.05，非參數檢驗)，SASP組及清腸溫中方各劑量組均較模型組有明顯的下降(P<0.05，非參數檢驗)，清腸溫中方高中低劑量組DAI水平較SASP組無明顯差異(P>0.05，非參數檢驗)，如表2。死亡情況：實驗過程中空白組無死亡，模型組死亡4只，柳氮磺吡啶組死亡1只，清腸溫中方高劑量組死亡3只，中劑量組死亡2只，低劑量組死亡1只。

表1 DAI日變化表

注：與DAY3比較，aP<0.05,bP>0.05；與DAY7比較，cP<0.05,dP>0.05；與空白組比較，eP<0.05；與模型組比較，fP<0.05；與SASP組比較，gP>0.05

2.2 大鼠結腸CMDI

模型組肉眼可見結腸黏膜糜爛重，潰瘍較深而且面積較大，潰瘍處有明顯腸內容物嵌入，不易沖洗；可見明顯水腫，充血，結腸表面覆蓋有紅褐色炎癥性偽膜；結腸病變處腸腔擴張變形；結腸與周圍組織粘連明顯，不易分離。各用藥組結腸與周圍組織粘連較輕，結腸表面未見紅褐色炎癥性偽膜，充血、水腫減輕，潰瘍呈愈合性表現。用藥10天后，模型組CMDI仍明顯高于空白組(P=0.003<0.05，非參數檢驗)，SASP組及清腸溫中方中劑量組較模型組均明顯下降(P<0.05，非參數檢驗)，此二組CMDI水平無明顯差異(P=0.671>0.05)，非參數檢驗)，如表2。

表2 清腸溫中方對TNBS誘導的結腸炎大鼠CMDI的影響

注：與空白組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與SASP組比較,cP>0.05

2.3 大鼠結腸病理

模型組光鏡下可見黏膜充血、水腫，大量炎性細胞浸潤,以淋巴細胞及中性粒細胞為主，病變深度達黏膜下層、肌層甚至漿膜層；杯狀細胞明顯減少，潰瘍周圍的部分腺體擴張,腺體排列紊亂，部分腺上皮細胞輕度增生及非典型增生，可見炎癥性肉芽腫。各治療組光鏡下可見充血、水腫減輕，炎細胞侵潤減輕，以淋巴細胞、漿細胞為主，中性粒細胞少見，個別結腸組織可見嗜酸性粒細胞，炎細胞侵潤層次變淺，集中在黏膜下層，如圖1。模型組結腸組織病理學評分明顯高于空白組(P=0.001<0.05，非參數檢驗)，清腸溫中方各個劑量組結腸組織病理學評分均明顯低于模型組(P<0.05，非參數檢驗)，其中清腸溫中方高、中劑量組炎細胞侵潤的程度明顯低于模型組(P<0.05，非參數檢驗)，如表3。

表3 清腸溫中方對TNBS誘導的結腸炎大鼠病理的影響

注：與空白組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05

A 空白組 B 模型組 C SASP組 D 高劑量組 E 中劑量組 F 低劑量組

3 討論

IBD在發展中國家的發病率逐年升高，現代醫學對IBD的治療局限于氨基水楊酸(水楊酸偶氮磺胺吡啶等)、皮質固醇類激素，及免疫調節劑、微生物制劑及生物靶向治療。氨基水楊酸類及激素類藥物具有較大臨床副作用及逐年出現的難治性IBD[9]，免疫調節劑、微生物制劑及生物靶向治療方法等新興的治療方法其臨床療效仍有待證據支持[10]，這些都限制了IBD的臨床治療。中醫藥療效的顯著性使得越來越多研究關注IBD的中醫藥治療。

清腸溫中方是北京中醫藥大學東方醫院消化內科李軍祥教授經過多年臨床總結的臨床經驗方，潰瘍性結腸炎患者的臨床以腹瀉，黏液膿血便，腹痛，里急后重為主癥，李軍祥教授認為其病機是脾虛為本，腸道濕熱為標，病機關鍵為寒熱錯雜，濕熱瘀阻，治療當清腸溫中，化瘀止血，制定清腸溫中方，治療臨床潰瘍性結腸炎取得很好的效果。本方主要由黃連、炮姜、三七等藥組成，方中黃連苦寒入血分，具有清腸止血的功效，炮姜既可溫脾止瀉，又可制黃連等諸藥之苦寒，三七化瘀止血，諸藥合用能起到清利腸道濕熱，溫中健脾，平調寒熱，化瘀止血的效果。現代研究顯示黃連的主要成分黃連素及其總生物堿均具有顯著的抗潰瘍及抗菌作用[11]，黃連總堿能通過抗氧化自由基、抑制炎細胞活性對動物結腸炎起到治療作用[12]。炮姜水溶物能有效縮短小鼠的出血時間[13]。基于此本研究組從結腸黏膜保護觀察清腸溫中方對IBD的作用。

本研究中以TNBS作用于SD大鼠構建類似于人類發病及癥狀的IBD動物模型，以清腸溫中方高中低劑量治療動物模型，觀察清腸溫中方對實驗性結腸炎大鼠腸黏膜的作用。TNBS造模3天后大鼠均出現明顯的血便，大便稀溏，形體消瘦，懶動，毛發無光澤等急性結腸炎癥的表現[4]，且DAI指數明顯增高，證明結腸炎動物模型構建成功。10天后，模型組CMDI及DAI下降，但較空白組仍有明顯的差異，可見TNBS誘導的結腸炎大鼠模型有一定的自愈性，但10天并不能完全愈合。藥物干預后清腸溫中方對結腸炎大鼠CMDI、DAI、HS均有明顯的改善作用，其中以中劑量組效果最為明顯(P<0.05)，清腸溫中方高、中劑量組炎細胞侵潤的程度明顯低于模型組(P<0.05)，可見清腸溫中方對TNBS誘導的結腸炎大鼠的結腸黏膜有保護作用，能有效改善結腸炎細胞侵潤，明顯的改善疾病癥狀，可以起到一定的治療作用，但作用機制并不明確，有待進一步研究。

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(本文編輯：黃凡)

EffectofQingchangWenzhongDecoctiononcolonicmucosaofTNBS-inducedcolitisrats

LIULi-juan,WANGYun-liang,SHIRui,etal.

DepartmentofGastroenterology,DongfangHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China

LIJun-xiang,E-mail:lijx970508@sohu.com

ObjectiveTo explore the effect of Qingchang Wenzhong Decoction(QCWZD)on colonic mucosa on a rat model of experimental inflammatory bowel disease (IBD).MethodsColitis was induced in male sprague-dawley (SD) rats by intracolonic administration of 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS), 100 mg/kg. QCWZD preparation and salazosulfapyridine (SASP) was given by gavage route daily for 10 days. Disease activity index(DAI), colonic mucosa damage index(CMDI), histological score(HS)were estimated.ResultsDAI, CMDI, HS was significantly higher in TNBS-treated rats (P<0.05); DAI and CMDI decreased in SASP-treated TNBS-induced colitis rats (P<0.05). QCWZD preparation reduced DAI,CMDI and HS of TNBS-induced rats (P<0.05); QCWZD preparation(1200 mg/kg, 600 mg/kg)reduced inflammatory infiltration(II) of colon(P<0.05).ConclusionsData obtained indicated that QCWZD could protect colonic mucosa by reducing inflammatory infiltration.

Qingchang Wenzhong Decoction; Disease activity index; Colonic mucosa damage index; Histological score; Inflammatory infiltration

北京中醫藥大學創新團隊資助項目(2011-CXTD-24)

100078 北京中醫藥大學東方醫院脾胃肝膽科[劉麗娟(博士研究生)、王允亮(博士研究生)、史瑞、魏仕兵(碩士研究生)、李軍祥]；北京中醫藥大學基礎醫學院(楊美娟)

劉麗娟(1984-)，女，2012級在讀博士研究生。研究方向：中醫藥防治慢性胃腸道疾病。E-mail: ljliu609@163.com

李軍祥(1964-)，博士，主任醫師，博士生導師。研究方向：中醫藥防治慢性肝膽和胃腸道疾病。E-mail: lijx970508@sohu.com

R254.6

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.03.006

2013-12-03)