補腎活血顆粒對帕金森大鼠腦腺苷A2A受體影響的研究

郭云霞 李紹旦 劉毅 楊明會

·論著·

補腎活血顆粒對帕金森大鼠腦腺苷A2A受體影響的研究

郭云霞 李紹旦 劉毅 楊明會

目的探討補腎活血顆粒治療帕金森病的作用機制。方法用6-羥基多巴損毀腦右側內側前腦束的方法建立帕金森大鼠模型。將33只SD模型大鼠隨機分為治療組18只和對照組15只，另設正常組15只，治療組以中藥補腎活血顆粒灌胃每日1次，連續8周。對照組及正常組同法以生理鹽水灌胃8周，灌胃結束、觀察帕金森大鼠旋轉行為變化，后斷頭取腦，免疫熒光法觀察大鼠腦腺苷A2A受體變化。結果治療組大鼠旋轉行為較對照組改善，治療組大鼠腦紋狀體A2A受體表達較對照組明顯減弱(P<0.01)，模型組比正常組表達顯著增強(P<0.01)。三組大鼠黑質中A2A受體均無表達。結論補腎活血顆粒能改善帕金森大鼠旋轉行為，抑制大鼠紋狀體腺苷A2A受體表達，對帕金森病治療起到較好療效。

補腎活血顆粒； 帕金森模型大鼠； 腺苷A2A受體

帕金森病(parkinsons disease，PD)是中老年常見的慢性神經系統退行性疾病，其特征是中腦黑質致密部多巴胺能神經元變性丟失，紋狀體多巴胺水平下降，發病機制尚不明確。主要治療藥物為左旋多巴制劑，長期應用后存在藥效下降或失效，出現不同程度的副作用。中藥在PD治療上有一定優勢，補腎活血顆粒是楊明會教授多年臨床經驗總結方，課題組通過制作帕金森大鼠動物模型，給予補腎活血顆粒干預后，觀察帕金森大鼠旋轉行為及大鼠腦腺苷A2A受體變化，探討補腎活血顆粒治療帕金森病的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級Sprague-Dawle(SD)雄性大鼠80只，體重190～210g左右，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥物與試劑

補腎活血顆粒由山茱萸20 g、肉蓯蓉10 g、何首烏15 g、川芎10 g、當歸10 g、丹參15 g、蜈蚣2條等組成，解放軍總醫院、全軍中醫研究所統一制成中藥顆粒沖劑，規格為一袋8 g，產品批號100101。

6%水合氯醛(北京化學試劑公司)，6-羥多巴(6-OHDA)(美國sigma公司)，阿樸嗎啡(沈陽第一制藥廠)。

1.3 儀器

大鼠腦立體定位儀(美國KOPF公司)，帕金森動物旋轉檢測儀(美國columbus instruments公司)微量注射泵，牙科鉆，外科手術器械，電子天平，超凈工作臺。

1.4 模型制備

80只大鼠隨機分為2組，模型組65只，正常組15只，模型組隨機分為造模組50只，假手術組15只，適應環境、正常飼養2周，行為學測試無旋轉行為后造模。術前12小時禁食，按照動物使用的3R原則[1]予人道關懷，稱重，6%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔內注射，麻醉后，俯臥位固定于腦立體定位儀上，頭部消毒，沿正中矢狀線暴露顱骨，調整門齒桿，使前后囟位于同一水平面上，按照包氏大鼠立體定位圖譜[2]定位右側內側前腦束(MFB)，于前囟后4.3 mm，矢狀線右旁開1.5 mm，進針深度7.6 mm，牙科鉆鉆透顱骨，微量注射泵吸取6-hydroxydopamine(6-OHDA)8 μl，注射速度為1 μl/min，每次注射后留針5分鐘，緩慢出針，縫合頭皮。假手術組以等量生理鹽水進行上述操作，正常組不做任何處理。

術后2周進行旋轉行為測試，給大鼠穿上束縛套后置于旋轉檢測儀中適應5分鐘，大鼠安靜后皮下注射阿樸嗎啡(0.5 mg/kg)，5分鐘后由旋轉檢測儀統一記錄旋轉次數，設定記錄時間為30分鐘。如大鼠恒定轉向左側，如旋轉數﹥210轉/30分，則為成功的帕金森大鼠模型。

1.5 模型分組與給藥

造模成功33只帕金森大鼠隨機分為治療組(補腎活血顆粒)18只、對照組15只，同設正常組15只,按照大鼠與人的藥物劑量換算公式，大鼠每公斤體重給藥量按成人(60 kg)每公斤劑量的10倍計算[3]溶于生理鹽水中，灌胃法給藥，給藥時間上午9∶00～10∶00，每天一次，每周稱重一次，調整給藥量，連續8周，對照組、正常組同樣方法給予等量生理鹽水灌胃。

1.6 取材及處理

將模型組及正常大鼠迅速斷頭取腦，將腦組織平放入放有錫紙的托盤中，托盤平放到液氮表面，將組織迅速冷凍，取出組織放至置于-80℃冰箱保存，冰凍切片機中切片,厚度約10 μm,冰凍切片丙酮固定2分鐘，磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)洗3次，每次5分鐘。含5%羊血清的抗體稀釋液在37°C封閉30分鐘。棄液不洗,按1/100比例加入一抗，4°C過夜。PBS洗3次，每次5分鐘，加入熒光標記的羊抗兔二抗，室溫反應1小時。PBS洗3次，每次5分鐘。DAPI復染細胞核。PBS洗3次，每次3分鐘。甘油封片。顯微鏡觀察并照相。

1.7 觀測指標

旋轉行為測試：灌胃結束后進行，方法同造模中旋轉行為測試。

腺苷A2A受體表達：陽性細胞數及熒光表達，紋狀體部位取5張切片，在200倍電鏡視野下計數100個細胞中陽性細胞數，把不同部位視野內的細胞數相加后取平均數，就是每張切片的陽性細胞數。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 旋轉行為測試

治療后治療組大鼠旋轉次數與治療前比較明顯下降(P<0.01)，治療后對照組大鼠旋轉次數與治療前比較無明顯變化(P>0.05)，治療后治療組大鼠旋轉次數較對照組明顯下降(P<0.01),見表1。

表1 兩組帕金森大鼠治療前后轉數

注：與治療前比較，aP<0.01；與對照組比較，bP<0.01

2.2 大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體陽性細胞數

治療組及對照組大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體陽性細胞均較正常組升高(P<0.01)，治療后治療組大鼠紋狀體腺苷A2A受體陽性細胞數較對照組明顯減少(P<0.01)，見表2。

表2 紋狀體腺苷A2A受體陽性細胞數

注：與正常組比較,aP<0.01;與對照組比較,bP<0.01

2.3大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體表達免疫熒光圖像

免疫熒光結果顯示在大鼠腦紋狀體部位，腺苷A2A受體在電鏡下觀察其染色呈紅色，主要表達于細胞核。正常組大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體陽性細胞數目偏少、染色偏淡，見圖1；對照組大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體陽性細胞數目偏多、染色深，見圖2；對照組大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體陽性細胞數目居于正常組與對照組之間，見圖3。

圖1 正常大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體表達圖像(電鏡，×20)

圖2 對照組大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體表達圖像(電鏡，×20)

圖3 治療組大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體表達圖像(電鏡，×20)

3 討論

帕金森病發病機制至今尚不明確，為了更好研究其發病機制，研發有效治療藥物，觀察藥物的安全性及有效性，需要建立能夠模擬人類帕金森病的動物模型。其中6-羥多巴損毀法(將6-羥多巴局部定向注射到黑質或紋狀體等部位，損傷黑質紋狀體多巴胺能神經元通路)制備帕金森病大鼠模型，在病理和生理及行為學上與人類帕金森病有許多相似之處，且經濟、方便、成功率高、穩定可靠，能夠將多巴胺受體激動劑(阿撲嗎啡)誘導的旋轉行為進行量化而被廣泛應用。

帕金森病屬于中醫“顫證”范疇，其病機在古籍文獻中最早見于《黃帝內經》“諸風掉眩皆屬于肝”，金元之前多數醫家認為是“外風”為患，之后眾多醫家多以“內風”立論，明清后認為風、火、痰、瘀是主要病因，與肝、脾、腎等臟腑，尤其是肝密切相關。現代多數醫家認為肝腎虧虛，氣血不足為本，風火痰瘀為標，為本虛標實之證。楊明會教授在多年的臨床經驗基礎上提出PD的腎虛血瘀之說，以補腎活血法治療PD，經反復優化篩選創建的中藥復方補腎活血顆粒，由山茱萸、肉蓯蓉、何首烏、川芎、當歸、丹參、蜈蚣等組成，山茱萸、肉蓯蓉、何首烏有補腎健腦之效，川芎、當歸、丹參具有養血活血通絡之功，蜈蚣其走竄之力最速，內達臟腑，外至經絡，凡氣血凝聚之處皆能開之，全方標本兼治，共奏補腎活血之功。

腺苷是內源性嘌呤核苷，目前已知4種腺苷受體(A1、A2A、A2B、A3)，屬G蛋白偶聯受體家族[4]。中樞神經系統中在紋狀體含量最豐富，其它區域表達水平很低[5]。腺苷A2A受體與多巴胺D2受體共同表達于紋狀體—蒼白球的中間棘狀神經元[6]，伏隔核的核心區及嗅結節[7]，兩者形成異源二聚體和/或異源低聚體，此二聚體可降低多巴胺D2受體的活性，阻斷多巴胺D2受體與G蛋白偶聯，在第二信使水平二者互相拮抗[8]。紋狀體中傳出神經元至少受γ-氨基丁酸和乙酰膽堿兩種神經遞質控制，這些神經遞質同時又受A2A受體的調節。A2A受體可以刺激紋狀體神經元中乙酰膽堿的釋放。阻斷腺苷A2A受體，可使多巴胺D2受體活性增加，調節紋狀體內γ-氨基丁酸能神經元、抑制乙酰膽堿和興奮性氨基酸，起到治療PD的作用。腺苷A2A受體拮抗劑作為非多巴胺靶點已發展成為治療PD的熱點[9]。

實驗中采用旋轉檢測儀記錄大鼠旋轉次數，采用免疫熒光法大鼠腦紋狀體及黑質腺苷A2A受體表達，結果發現應用補腎活血顆粒干預后，治療組大鼠旋轉行為與治療前相比明顯改善，模型組大鼠無明顯變化，提示補腎活血顆粒可以改善PD模型大鼠旋轉行為。腺苷A2A受體在帕金森大鼠腦紋狀體有廣泛表達，而在黑質中無表達，與既往文獻報道一致[5]。腺苷A2A受體在電鏡下染色呈紅色，正常大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體表達較帕金森模型大鼠減弱，治療組與對照組比較表達又減弱，說明應用補腎活血顆粒干預后帕金森大鼠腦紋狀體中腺苷A2A受體表達減弱，課題組推測補腎活血顆粒治療帕金森病的作用機制可能與抑制腺苷A2A受體表達有關，抑制腺苷A2A受體表達、間接升高多巴胺D2受體的活性，起到了多巴胺受體保護的作用。

[1]Russell WMS, Burch RL. The Principles of Humane Experimental Technique[ M] . London: Methuen, 1959.

[2]包新民,舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜[M].北京：人民衛生出版社，1991：49-59．

[3]施新猷．醫學動物實驗方法[M].北京：人民衛生出版社,1986：11．

[4]ChuYY, TuKH, Lee YC, et al .Characteri zation of the ratA2a adenosine receptor gene . DNA Cell [J]. Bio,1996,15(4):329-337.

[5]Svenningsson P，Hall H，Sedvai1 G，et al．Distribution of adenosine receptors in the postmortem human brain：an extended autora-diographic study[J]．Synapse，1997，27(4)：322-335．

[6]Fink JS,Weaver DR， Rivkees SA， et al.Molecular Cloning of the rat A2 adenosine recepoter :Selective co-expression with D2 dopamine receptors in rat striatum[J]. Brain Res Mol Brain Res,1992，14:186-195

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[8]Fuxe K ,Ferre S,Canals M， et al. Adenosine A2A and dopamine D2 heteromeric receptor complexes and their function[J]. Journal of Molecular Neuroscience,2005，26(2-3):209-220.

[9]Pinna A，Wardas J ，Simola N，et al．New therapies for the treatment of Parkinsons disease：Adenosine A2A receptor antagonists [J]．Life Sci，2005，77(26)：3259-3267．

(本文編輯：秦楠)

EffectofBushenHuoxueGranule(BSHXG)onadenosineA2AreceptorinbrainofParkinsonsdisease(PD)rats

GUOYun-xia,LIShao-dan,LIUYi,etal.

DepartmentofTraditionalChineseMedicine,PLAGeneralHospital,Beijing100853,China

Correspondingauther:YANGMing-hui,E-mail:ymh9651@yahoo.com.cn

ObjectiveTo explore the mechanism of treating Parkinson’s disease(PD)with Bushen Huoxue Granule(BSHXG).MethodsEstablishing rat model of PD with 6-hydroxydopamine lesion as medial forebrain bundle the right side of the brain of. 33 PD rats modes were randomly divided into treatment group 18 (BSHXG group) and control group 15. Additionally other 15 SD rats were selected in normal group. BSHXG was applied for treatment group once daily for 8 weeks. Physiologic saline was applied for control group and normal group in the same way. Gavage end, observed changes in the rotational behavior of PD rats. After decapitated, Immunofluorescence was used to observe the changes of adenosine A2A receptor in rat brain.ResultsRotational behavior of rats in the treatment group was much better improved than in the control group.A2A receptor expression in the treatment group compared with the control group was significantly decreased(P<0.01).A2A receptor expression in the model group was significantly increased than the normal group(P<0.01). A2A receptor were not expression in three groups of rats substantia nigra.ConclusionBSHXG can improve the rotational behavior of PD rats, inhibit adenosine A2A receptor expression in PD rat striatum, and has a significant therapeutic effect on the treatment of Parkinson’s disease.

Bushen Huoxue Granule(BSHXG); Parkinson’s disease rats; Adenosine A2A receptor

國家自然科學基金(81273969)

100853 北京，解放軍醫學院[郭云霞(博士研究生)]；解放軍總醫院中醫科(郭云霞、李紹旦、劉毅、楊明會)

郭云霞(1976- )，女，2011級在讀博士研究生。研究方向：中西醫結合老年病。E-mail: guoyx1999@sina.com

楊明會(1962- )，博士，教授，主任醫師，博士生導師。中華中醫藥學會副會長，中國人民解放軍中醫藥學會會長。研究方向：老年病中醫研究。E-mail: ymh9651@yahoo.com.cn

R742.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.03.002

2014-01-15)