固定化丁酸梭菌轉化甘油生產1,3-丙二醇的研究

張藍藍，王世珍，朱春杰，方柏山,3*

(1.廈門大學化學化工學院，2.廈門市合成生物技術重點實驗室(廈門大學)，3.醇醚酯化工清潔生產國家工程實驗室(廈門大學)，福建 廈門 361005)

1,3-丙二醇是一種廣泛用于制備聚酯、聚醚和聚氨酯的重要單體原料[1-4]，這類聚合物合成塑料具有生物可降解性等許多其他二元醇所不具有的優良性質，因而1,3-丙二醇在有機合成領域的應用正日益增加．

填充床固定化細胞生物反應器操作簡單、易于擴大生產規模，可實現連續化生產，生產費用較低，但難以清除細胞，混合度較差[5]．膜式固定化細胞生物反應器催化效率很高，易于放大及控制反應過程，下游處理簡便，是目前連續化大生產中應用最多的一種生物反應器[6]．目前，利用生物法發酵生產1,3-丙二醇主要有分批發酵、補料發酵、連續發酵3種方式，不同的發酵方式對最終產物的濃度及時空產率都有著較大的影響[3,5,7-9]．Pflügl等[10]利用Lactobacillusdiolivorans進行補料分批發酵，通過控制培養基中葡萄糖和甘油的摩爾比及添加維生素B12的方式，1,3-丙二醇最高質量濃度可達84.5 g/L．Zhao等[11]利用NaCS/PDMDAAC微膠囊包埋克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)進行連續發酵，1,3-丙二醇最高質量濃度達到13.6 g/L，時空產率為4.49 g/(L·h)，摩爾得率為43%．而Casali等[12]利用填充床反應器固定化成團泛生菌(Pantoeaagglomerans)菌體進行連續發酵，在水力停留時間為2 h時時空產率達到最高值3.6 g/(L·h)．而利用棉纖維織物、聚乙烯醇縮甲醛(PVF)柱體、活性炭顆粒固定化丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)進行連續發酵生產1,3-丙二醇的研究尚未報道，故本文考慮采用不同的固定化載體及不同的連續發酵條件對其進行初步研究，旨在提高菌株的發酵生產能力，為今后大規模的工業化發酵應用打下基礎．

1 實驗材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

丁酸梭菌(ClostridiumbutyricumCGMCC 6317)．4 ℃保存于生長培養基．

1.1.2 培養基

1) 生長培養基(RCM培養基)(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉3，葡萄糖5，NaCl 3，NaAc 3，可溶性淀粉1，半胱氨酸鹽酸鹽0.5；pH 7.5．

2) 種子培養基(g/L)：甘油20，K2HPO4·3H2O 4.45，KH2PO41.3，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.02，酵母粉1；另加微量元素溶液1 mL，Fe溶液1 mL．

3) 發酵培養基(g/L)：甘油，視具體情況而定；K2HPO4·3H2O 1，KH2PO40.5，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.02，酵母粉1；另加微量元素溶液1 mL，Fe溶液 1 mL；pH 7．

4) 補料培養基：甘油及酵母粉視具體情況而定，其余同種子培養基．

5) 微量元素溶液(g/L)：ZnCl20.07，MnCl2·4H2O 0.1，H3BO30.06，CoCl2·6H2O 0.2，CuCl2·2H2O 0.02，NiCl2·6H2O 0.025，Na2MoO4·2H2O 0.035；HCl(質量分數37%，下同)0.9 mL．

6) Fe溶液(g/L)：FeSO4·7H2O 5；HCl(37%)4 mL．

1.2 實驗方法

1.2.1 培養條件

1) 培養基制備：將配制好的培養基分裝至血清瓶，通氮氣除氧30 min，使用膠塞和鋁蓋密封，高壓滅菌(121 ℃，20 min)；補料培養基滅菌后持續通入無菌氮氣，以保持厭氧環境．

2) 種子培養：用無菌注射器取2 mL菌液接種至內含50 mL種子培養基的血清瓶，37 ℃、200 r/min搖床培養，培養16 h；再以10%(體積分數，下同)的接種量轉接，培養條件同前，4 h后接入發酵罐培養．

3) 發酵罐培養：以10%的接種量轉接入罐中發酵培養基，150 r/min、35 ℃、pH 7.0條件下恒溫培養一定時間．

4) 連續發酵培養：將新鮮發酵培養基用恒流泵以恒定流速(依具體實驗而定)輸入固定化反應器，反應器保持在35 ℃水浴恒溫條件下；流出液取樣點為反應器出口處；反應器與發酵罐連成回流系統，采用蠕動泵控制回流系統內部循環流速為2 mL/min；發酵罐中發酵培養基體積為1 L；采用發酵罐控制整個系統pH為 7.0，轉速150 r/min．

5) pH調節：除特殊說明外，pH調節均采用4 mol/L的NaOH溶液自動調節發酵液pH為7.0．

1.2.2 載體處理方法

采用的吸附型載體包括棉纖維織物、PVF柱體、活性炭顆粒．

棉纖維織物預處理：34 cm(寬)×30 cm(高)棉纖維織物(市售純白色毛巾，厚5 mm，孔隙率>95%，密度0.25 g/cm3，比表面積>40 m2/m3)沸水浴30 min，60 ℃烘箱烘干24 h．將經過處理的棉纖維織物鋪放在稍大面積的不銹鋼絲網上，兩者共同以短邊為軸垂直卷成圓筒狀，形成織物層和鋼絲網層交替分布的圓柱體．將圓柱體置于夾套玻璃柱反應器(Ф 4 cm×38 cm)內，工作(填充)體積355 mL．

PVF柱體預處理：PVF柱體為Ф 4 cm×12.5 cm圓柱體(密度1.2 g/cm3，孔隙率約為80%，比表面積約為0.5 cm2/g，臺灣長春石化公司)．去離子水浸泡24 h，60 ℃烘箱烘干24 h．夾套玻璃柱反應器(Ф 4 cm×38 cm)內部填充PVF柱體，工作(填充)體積170 mL．

活性炭顆粒預處理：20～50目活性炭顆粒(比表面積500～1 000 m2/g，相對密度約1.9～2.1，表觀相對密度約0.08～0.45，分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，沖洗粉塵，1 mol/L HCl溶液浸泡24 h，去離子水沖洗，20 g/L NaOH溶液浸泡24 h，去離子水再次沖洗；生理鹽水(9 g/L NaCl)浸泡24 h，60 ℃烘箱烘干24 h．稱取定量材料，牛皮紙包裹于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，60 ℃烘箱烘干．使用時，稱取定量材料(Ф 4 cm×25 cm)裝填入玻璃反應柱，工作(填充)體積295 mL．

1.2.3 細胞動態吸附

夾套玻璃柱反應器(Ф 4 cm×38 cm)35 ℃水浴恒溫，通入氮氣保持厭氧環境．發酵罐取樣口由軟管與玻璃柱反應器連接，初始菌液OD值控制在2.5～3.0．夾套玻璃柱反應器內部填充任一載體材料，上端加蓋密封．菌液由蠕動泵經軟管循環至玻璃柱反應器內(見圖1)，循環流速控制為2 mL/min．在發酵溫度下動態吸附4～6 h(或者至進出口OD650值平衡)．

1.2.4 發酵方法

菌體細胞動態吸附結束后，將新鮮補料培養基替換玻璃柱反應器及發酵罐內甘油耗盡的發酵液(見圖1)．將補料培養基連續補加至玻璃柱反應器中，利用蠕動泵控制玻璃柱反應器進出口流速及發酵罐與玻璃柱反應器的內循環流速(2 mL/min)，保持發酵過程中反應液體積恒定．操作過程均采用無菌氮氣保持厭氧環境．

圖1 填充床生物反應器操作流程Fig.1 Schematic diagram of operation process for the fixed-bed bioreactor

1.2.5 分析方法

發酵液搖勻，于650 nm處測定OD值，根據細胞質量濃度和OD的關系曲線，可推算游離細胞質量濃度．OD值與細胞質量濃度的換算比例為1OD為細胞質量濃度0.48 g/L．

每次取發酵液10 mL，離心后取上清液于4 ℃保存，稀釋，并用20 nm微孔濾膜過濾3次，采用高效液相色譜(HPLC)分析甘油和1,3-丙二醇的質量濃度．

色譜條件為：HPLC Aminex-HPX-87H色譜柱，流動相為0.5 mmol/L的硫酸超純水水溶液，流速為0.5 mL/min，柱溫30 ℃，示差折光檢測器．

1,3-丙二醇摩爾得率=1,3-丙二醇生成量/甘油消耗量；1,3-丙二醇時空產率=1,3-丙二醇生成量/(工作體積·發酵時間)．

2 結果與討論

2.1 不同載體對固定化丁酸梭菌連續發酵過程的影響

反應器內的流體流型、傳質狀態和發酵液的停留時間均與反應器中的固定化載體類型有聯系．本文選取棉纖維織物、PVF柱體、活性炭顆粒這3種常見的吸附型載體作為研究對象，考察不同載體對丁酸梭菌的固定化效果和對固定化丁酸梭菌連續發酵過程的影響．將4種連續發酵條件下的結果列于表1和2中．

從表1和2的結果可知，與游離連續發酵相比，以棉纖維織物、活性炭顆粒和PVF柱體為固定化材料的固定連續發酵水平都得到顯著提高，因為菌體固定化后可使更多的菌體保留在反應器內；相比于游離連續發酵，反應器內菌體濃度得到提高，故有效提高了丁酸梭菌代謝甘油生產1,3-丙二醇的水平．

在補料培養基中甘油質量濃度和發酵時間接近的條件下，以棉纖維織物和活性炭顆粒為固定化載體時，甘油幾乎被完全消耗，殘余甘油質量濃度接近0，最終1,3-丙二醇的質量濃度分別為17.1和13.4 g/L．以活性炭顆粒為固定化載體時，1,3-丙二醇的摩爾得率較高，為61%；以棉纖維織物為固定化載體時，1,3-丙二醇的時空產率較高，為2.4 g/(L·h)．

表1 不同載體下的填充床連續發酵穩定態結果Tab.1 Steady-state results of continuous cultures in the fixed-bed bioreactor at different carriers g/L

注：對照樣為無載體．

在3種固定化載體中，以PVF柱體為固定化載體時，1,3-丙二醇的時空產率最高，為6.3 g/(L·h)；但在其發酵過程中，泡沫現象嚴重，PVF柱體具有一定的壓縮性，對工業化生產不利．

以上結果表明，棉纖維織物和活性炭顆粒較PVF柱體為較優的固定化載體，另外，活性炭顆粒較棉纖維織物成本更低且容易裝填，因此后續研究以活性炭顆粒為固定化載體．

表2 不同載體下的填充床連續發酵最終結果Tab.2 Total results of continuous cultures in the fixed-bed bioreactor at different carriers

注：工作(填充)體積：棉纖維織物355 mL，PVF柱體170 mL，活性炭顆粒295 mL；工作(液體)體積，

對照樣1 500 mL．

2.2 補料培養基中初始甘油質量濃度對固定化發酵的影響

固定化細胞反應器能適應的底物質量濃度和可重復利用性是衡量一個固定化細胞反應器成功與否的重要指標．選用活性炭顆粒作為固定化載體，考察補料培養基的甘油質量濃度對固定化丁酸梭菌發酵的影響．將經前處理的活性炭顆粒裝填入反應器，操作過程同1.2.2，操作條件見表3(補料培養基中甘油質量濃度不同)，相應的連續發酵結果分別見圖2(a)～(c)．

在表3中，操作條件Ⅰ為發酵罐的菌體培養過程；操作條件Ⅱ 為發酵罐和玻璃柱反應器之間的內循環過程，菌體在此過程中吸附于玻璃柱反應器的載體上；操作條件Ⅲ為玻璃柱反應器中發酵液的置換過 程，用新鮮補料培養基替換甘油耗盡的發酵液；操作條件Ⅳ為玻璃柱反應器中補料流加的連續發酵過程．

表3 固定化丁酸梭菌的發酵操作條件Tab.3 Operational conditions for continuous fermentation of glycerol by C. butyricum

圖2 動態吸附、置換及連續發酵曲線 Fig.2 The curves of cell adsorption to carbon granules,replacement of medium,continuous fermentation

由圖2(a)可以看出，發酵液中殘余甘油質量濃度較高，可能原因是發酵液中產物和副產物的抑制作用，使菌體活性下降．

由于補料培養基中甘油質量濃度較高，圖2(a)中發酵結束時甘油的殘留量較高，因此，將補料培養基中的甘油質量濃度降至20 g/L，其他操作條件見表3(b)．

注：工作(填充)體積為295 mL．

由圖2(b)可見，連續發酵過程中情況較為穩定，游離細胞、甘油、1,3-丙二醇的質量濃度均略有下降，丁酸和乙酸的質量濃度變化均較小．在連續發酵開始時甘油質量濃度為20 g/L，固定化丁酸梭菌可將甘油徹底轉化為1,3-丙二醇．

由于補料培養基中甘油質量濃度較低，圖2(b)中的發酵結束時，雖然底物完全消耗，但1,3-丙二醇的最終質量濃度較低，因此，將補料培養基中的甘油質量濃度折中調整為135 g/L，其他操作條件見表3(c)．

綜合以上(補料培養基中初始甘油質量濃度、殘余甘油質量濃度、1,3-丙二醇最終質量濃度、1,3-丙二醇摩爾得率、1,3-丙二醇時空產率等)結果，得出表4．

由表4中的結果可以看出，補料培養基中甘油質量濃度越低，殘余甘油質量濃度越低．當甘油質量濃度為20 g/L時，甘油基本完全消耗；為252 g/L時，殘余甘油質量濃度96.3 g/L，約為135 g/L時的2倍．

當初始甘油質量濃度為20 g/L時，1,3-丙二醇的摩爾得率最高，但1,3-丙二醇的時空產率最低，為135 g/L時的54%，為252 g/L時的32%．同時，當甘油質量濃度為20 g/L時，1,3-丙二醇最終質量濃度最低，為135 g/L時的43%，為252 g/L時的25%．

以上結果表明，補料培養基的甘油質量濃度對固定化連續發酵有較大的影響，甘油質量濃度越高，1,3-丙二醇的質量濃度和時空產率也隨之升高，但殘余甘油質量濃度也越高；對1,3-丙二醇的摩爾得率影響不大，但有降低趨勢．

3 結 論

本文采用活性炭顆粒作為丁酸梭菌固定化載體發酵甘油生產1,3-丙二醇，同條件下，1,3-丙二醇連續發酵時空產率1.9 g/(L·h)遠高于無載體時的0.3 g/(L·h)，說明該方法可有效穩定細胞活性；殘余甘油質量濃度0.1 g/L遠低于無載體時的30.0 g/L，1,3-丙二醇質量濃度13.4 g/L遠高于無載體時的2.8 g/L，說明該方法可提高細胞對底物的利用率及對產物的耐受性；最后，采用固定化方法可降低產物后期處理工序難度．與Zhao等[11]利用NaCS/PDMDAAC微膠囊包埋克雷伯氏肺炎桿菌進行補料分批發酵相比，本文采用的固定化載體成本低廉，便于操作．補料培養基的甘油質量濃度對固定化連續發酵有較大影響，甘油質量濃度越高，殘余甘油質量濃度就越高，1,3-丙二醇的質量濃度和時空產率也隨之升高，但對1,3-丙二醇摩爾得率影響不大．綜上，我們將更廣泛地研究多類適用于工業化的固定化載體，對反應器、培養基、反應條件等多方面進行優化綜合，最終提高工業化生產1,3-丙二醇的摩爾得率和時空產率．

[1] 吳從意,陳靜.1,3-丙二醇制備研究進展[J].分子催化,2012,3:38-40.

[2] Metsoviti M,Zeng A P,Koutinas A A,et al.Enhanced 1,3-propanediol production by a newly isolatedCitrobacterfreundiistrain cultivated on biodiesel-derived waste glycerol through sterile and non-sterile bioprocesses[J].Journal of Biotechnology,2013,163(4):408-418.

[3] Kaur G,Srivastava A K,Chand S.Advances in biotechnological production of 1,3-propanediol[J].Biochemical Engineering Journal,2012,64:106-118.

[4] Kubiak P,Leja K,Myszka K,et al.Physiological predisposition of variousClostridiumspecies to synthetize 1,3-propanediol from glycerol[J].Process Biochemistry,2012,47(9):1308-1319.

[5] Chang H N.2.40-Multistage continuous high cell density culture[M]∥Comprehensive Biotechnology.2nd ed.[S.l.]:Pergamon,2011:537-577.

[6] Sotenko M V,Rebro? M,Sans V S,et al.Tandem transformation of glycerol to esters[J].Journal of Biotechnology,2012,162(4):390-397.

[7] Metsoviti M,Paraskevaidi K,Koutinas A,et al.Production of 1,3-propanediol, 2,3-butanediol and ethanol by a newly isolatedKlebsiellaoxytocastrain growing on biodiesel-derived glycerol based media[J].Process Biochemistry,2012,47(12):1872-1882.

[8] Clomburg J M,Gonzalez R.Anaerobic fermentation of glycerol:a platform for renewable fuels and chemicals[J].Trends in Biotechnology,2013,31(1):20-28.

[9] Chatzifragkou A,Aggelis G,Komaitis M,et al.Impact of anaerobiosis strategy and bioreactor geometry on the biochemical response ofClostridiumbutyricumVPI 1718 during 1,3-propanediol fermentation[J].Bioresource Technology,2011,102(22):10625-10632.

[10] Pflügl S,Marx H,Mattanovich D,et al.1,3-Propanediol production from glycerol withLactobacillusdiolivorans[J].Bioresource Technology,2012,119:133-140.

[11] Zhao Yanan,Chen Guo,Yao Shanjing.Microbial production of 1,3-propanediol from glycerol by encapsulatedKlebsiellapneumoniae[J].Biochemical Engineering Journal,2006,32(2):93-99.

[12] Casali S,Gungormusler M,Bertin L,et al.Development of a biofilm technology for the production of 1,3-propanediol(1,3-PDO) from crude glycerol[J].Biochemical Engineering Journal,2012,64:84-90.