HPLC法同時(shí)測(cè)定金針菇中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的含量

易承學(xué)，童珊珊，徐希明，余江南

（1.鎮(zhèn)江市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江212004；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

HPLC法同時(shí)測(cè)定金針菇中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的含量

易承學(xué)1，2，童珊珊2，徐希明2，余江南2

（1.鎮(zhèn)江市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江212004；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：建立高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法同時(shí)測(cè)定金針菇中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇含量。方法：采用Inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱同時(shí)測(cè)定上述2種成分，流動(dòng)相為甲醇，流速1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為282 nm，柱溫25℃。結(jié)果：麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的進(jìn)樣量在0.025～1.5μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r＝0.999 9）；平均回收率（n＝6）分別為104.6%［相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＝0.89%］，103.5%（RSD＝3.34%）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確，適用于測(cè)定金針菇中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的含量。

金針菇；麥角甾醇；22，23-二氫麥角甾醇；高效液相色譜法

金針菇（Flammulina velutipes），又名金錢(qián)菌、樸菇、冬菇、毛柄金錢(qián)菌，屬真菌門(mén)（Eumycota），擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales），口蘑科（Tricholomataceae），小火焰菌屬（Flammulina）或金錢(qián)菌屬（Collybia），營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值均較高，是中外著名的食用菌之一［1］。其蛋白質(zhì)、多糖和糖蛋白具有抗腫瘤、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫等生物活性，均已被分離出［2－3］。此外，還發(fā)現(xiàn)一些麥角甾烷類和豆甾烷類化合物，其中，麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇含量最高［4］。麥角甾醇是真菌類的特征甾醇，具有抗腫瘤、利尿作用［5－6］，同時(shí)，也是一些中藥及中藥制劑的指標(biāo)性成分［7－8］。22，23-二氫麥角甾醇經(jīng)紫外線照射后可以轉(zhuǎn)化為維生素D4，后者在動(dòng)物體組織內(nèi)的分布狀況與D3相似，但排泄速度較D3快，在高劑量作用下毒性更低［9］。

麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇在金針菇中含量較高，故可作為金針菇的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。麥角甾醇的測(cè)定方法有UV法［10］、TLC法［11］、HPLCUV法［7－8］和GC法［12］等，而目前尚未見(jiàn)有關(guān)同時(shí)測(cè)定金針菇中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬建立一種高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析方法，同時(shí)測(cè)定上述兩種成分。

1 儀器與試劑

Shimadzu高效液相色譜儀（包括LC-20AT泵，SPD-20A紫外檢測(cè)器，N2000色譜工作站）；ALC-110.4電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；麥角甾醇對(duì)照品（Acros Organics，純度98%，批號(hào)A0279702），22，23-二氫麥角甾醇對(duì)照品（自制，結(jié)構(gòu)經(jīng)光譜方法鑒定，純度＞98%）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；金針菇（鎮(zhèn)江正東菇業(yè)有限公司提供）于55℃鼓風(fēng)干燥備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇，流速1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為282 nm，柱溫25℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品麥角甾醇15.16 mg和22，23-二氫麥角甾醇15.26 mg，分別置于25 mL量瓶中，甲醇溶解后定容至刻度，配制成對(duì)照品母液。經(jīng)逐步定量稀釋，制成含麥角甾醇為1.213，4.851，24.256，48.512，72.768μg·mL－1和22，23-二氫麥角甾醇為1.221，4.883，24.416，48.832，73.248μg·mL－1的系列混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取過(guò)100目篩的金針菇細(xì)粉0.3 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱重，超聲（功率500 W，頻率40 KHz）處理30 min，冷卻至室溫，再稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20μL，利用液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn)，該色譜條件下，麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均不低于6 000。

圖1 對(duì)照品和金針菇的HPLC色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”中系列對(duì)照品溶液各20μL注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，求得麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇線性回歸方程分別為Y＝706 730X＋637.72，r＝0.999 9；Y＝579 038X＋137 9，r＝0.999 9，線性范圍為0.025～1.5μg。

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積值。計(jì)算麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n＝5）分別為0.25%和0.55%，說(shuō)明儀器性能良好。

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批金針菇粉末樣品6份，制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇含量平均值（n＝6）分別為0.30%，0.072%；RSD分別為0.29%，0.78%。說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，25℃室溫下放置，分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇峰面積的RSD（n＝6）分別為0.76%和1.46%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇含量金針菇粉末樣品（分別為0.30%和0.072%）6份，每份0.3 g，精密稱定，分別精密加入各對(duì)照品適量（與0.3 g樣品中各待測(cè)成分的量相當(dāng)），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇峰的平均加樣回收率（n＝6）分別為104.6%，103.5%；RSD分別為0.89%，3.34%。

2.3.7 樣品含量測(cè)定 分別精密稱取不同批次生產(chǎn)的金針菇細(xì)粉約0.3 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行色譜測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

3.1 藥材提取方法

本實(shí)驗(yàn)分別考察了索氏加熱回流提取6、10 h

表1 不同批次金針菇樣品中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的含量 %，n＝2

和超聲提取10，20，30，40，60 min對(duì)樣品中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇提出率的影響。結(jié)果顯示，超聲30 min與索氏加熱提取無(wú)明顯差別，故選擇操作方法相對(duì)簡(jiǎn)便的超聲30 min的提取方法。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同提取方法測(cè)定麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的含量 %，n＝2

3.2 流動(dòng)相選擇

在100%甲醇的條件下，甾醇峰形尖銳對(duì)稱，保留時(shí)間合適，2種成分均能與雜質(zhì)達(dá)到很好分離。增加水的比例后發(fā)現(xiàn)峰形變寬，保留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，故確定100%甲醇作為流動(dòng)相。

3.3 結(jié)果分析

從表1知，不同批次生產(chǎn)的金針菇中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇含量變化不大，充分體現(xiàn)出食用菌工廠化生產(chǎn)不受外界自然條件影響，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本文建立的HPLC法，適合同時(shí)檢測(cè)金針菇中上述2種成分。

［1］ 郭美英.中國(guó)金針菇生產(chǎn)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000：18.

［2］ Smiderle FR，Carbonero ER，Sassaki GL，et al.Characterization of a heterogalactan：some nutritional values of the ediblemushroom Flammulina velutipes［J］.Food Chem，2008，108（1）：329－333.

［3］ Shin KS，Yu KW，Lee HK，et al.Production of anticomplementary exopolysaccharides from submerged culture of Flammulina velutipes［J］.Food Technol Biotechnol，2007，45（3）：319－326.

［4］ Yi CX，F(xiàn)u M，Cao X，et al.Enhanced oral bioavailability and tissue distribution of a new potential anticancer agent，F(xiàn)lammulina velutipes sterols，through liposomal encapsulation［J］.J Agric Food Chem，2013，61（25）：5961－5971.

［5］ Takaku T，Kimura Y，Okuda H.Isolation of an antitumor compound from Agaricus blazei Murill and itsmechanism of action［J］.J Nutr，2001，131（5）：1409－1413.

［6］ Zhao YY，Xie RM，Chao X，et al.Bioactivity-directed isolation，identification of diuretic compounds from Polyporus umbellatus［J］.JEthnopharm，2009，126（1）：184－187.

［7］ 張萍，肖新月，黃瑋，等.RP-HPLC-UV法測(cè)定5種發(fā)酵蟲(chóng)草制劑中麥角甾醇的含量［J］.藥物分析雜志，2011，31（2）：258－260.

［8］ 趙英永，趙曄，林瑞超，等.RP-HPLC法測(cè)定豬苓中麥角甾醇的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29（6）：898－900.

［9］ Phillips KM，Horst RL，Koszewski NJ，et al.Vitamin D4in mushrooms［J］.PLoS ONE，2012，7（8）：e40702.

［10］ Arnezeder Ch，KolianderW，HampelWA.Rapid determination of ergosterol in yeast cells［J］.Analytica Chimica Acta，1989，225：129－136.

［11］ Larsen T，Axelsen J，Ravn HW.Simplified and rapid method for extraction of ergosterol from natural samples and detection with quantitative and semi-quantitative methods using thin-layer chromatography［J］.JChromatogr A，2004，1026（1／2）：301－304.

［12］ Phillips KM，Ruggio DM，Horst RL，et al.Vitamin D and sterol composition of10 types ofmushrooms from retail suppliers in the United States［J］.J Agric Food Chem，2011，59（14）：7841－7853.

High performance liquid chromatography for simultaneous determ ination of ergosterol and 22，23-dihydroergosterol in Flammulina velutipes

YICheng-xue1，2，TONG Shan-shan2，XU Xi-ming2，YU Jiang-nan2
（1.Departmentof Clinical Laboratory，Zhenjiang Center for Disease Control and Prevention，Zhenjiang Jiangsu 212004；2.School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To develop an efficient high performance liquid chromatography（HPLC）method for the simultaneous determination of ergosterol and 22，23-dihydroergosterol in Flammulina velutipes.M ethods：Chromatographic separation was achieved on an Inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm，5μm）analytical column using amobile phase of 100%methanol at1.0 mL·min－1.The sterol contentwas detected at282 nm.The temperature of column was25℃.Results：The established linearity range for ergosterol and 22，23-dihydroergosterol was 0.025－1.5μg（r＝0.999 9）.The average recoveries（n＝6）were 104.6%with RSD 0.89%，103.5%with RSD 3.34%，respectively.Conclusion：The established HPLCmethod was simple，rapid and reliable for the separation and simultaneous determination of ergosterol and 22，23-dihydroergosterol in Flammulina velutipes.

Flammulina velutipes；ergosterol；22，23-dihydroergosterol；high performance liquid chromatography

R917

A

1671－7783（2014）02－0126－03

10.13312／j.issn.1671-7783.y130281

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30973677）；教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目（20113227110012）

易承學(xué)（1983—），男，湖南衡陽(yáng)人，主管技師，博士；余江南（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：yjn＠ujs.edu.cn

2014－01－01 ［編輯］ 劉星星