MSCs旁分泌對多柔比星誘導的H9C2細胞凋亡的影響

劉玲玲，趙龍，李曉麗，張贏予，王好，周艷芳，張國輝

（江蘇大學附屬人民醫院心內科，江蘇鎮江212002）

MSCs旁分泌對多柔比星誘導的H9C2細胞凋亡的影響

劉玲玲，趙龍，李曉麗，張贏予，王好，周艷芳，張國輝

（江蘇大學附屬人民醫院心內科，江蘇鎮江212002）

目的：探討骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）旁分泌因子肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）對多柔比星誘導的H9C2細胞凋亡的影響及其機制。方法：將SD大鼠MSCs傳代至第3代后分為未轉染組、轉染HGF-siRNA組及轉染陰性對照（NC）-siRNA組，分別進行相應處理。通過ELISA、蛋白質印跡法檢測各組MSCs細胞上清中及細胞中HGF、轉化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）含量和蛋白表達量。用濃度為1μmol／L的多柔比星處理H9C2細胞4 h后分為4組：單獨培養組、MSCs共培養組、與HGF-siRNA-MSCs共培養組及與NC-siRNA-MSCs共培養組。培養24 h后通過流式細胞術AnnexinⅤ／PI雙染法檢測H9C2細胞凋亡率。結果：HGF-siRNA組MSCs上清中TGF-β1濃度為（519.23±24.34）pg／mL，明顯高于未轉染組［（459.65±11.78）pg／mL］及NC-siRNA組［（459.33±11.78）pg／mL］（P均＜0.05）；轉染HGF-siRNA組MSCs中TGF-β1表達量亦明顯高于其他兩組。HGF-siRNA-MSCs與H9C2細胞共培養組中H9C2細胞凋亡率為（18.54±0.64）%，較MSCs共培養組［（6.65± 0.49）%］及NC-siRNA-MSCs共培養組［（9.70±1.62）%］明顯增加（P均＜0.05）。結論：MSCs旁分泌因子HGF通過抑制TGF-β1的表達對多柔比星誘導的H9C2細胞凋亡起保護作用。

骨髓間充質干細胞；旁分泌；肝細胞生長因子；轉化生長因子-β1；細胞凋亡；多柔比星

骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells， MSCs）是一種來源于骨髓間質的多功能干細胞，具有向多種細胞分化的潛能。最初對其在心臟疾病方面的研究側重于MSCs向心肌細胞的分化，但越來越多的文獻報道，MSCs向心肌細胞分化的數量極少［1］，不足以解釋其對心臟功能的恢復作用，且發現MSCs可分泌較多的細胞因子［2］。目前已被確認的細胞因子包括肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF），胰島素樣生長因子，基質細胞衍生因子，血管內皮生長因子，堿性成纖維細胞生長因子，轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等近40種。HGF具有抗心肌細胞凋亡、促進血管再生的作用。TGF-β1在心臟損傷、修復以及心臟重構中起著關鍵作用。TGF-β1除了促進心肌肥大和纖維化，還能導致心肌細胞凋亡［3］。

本課題組在近幾年的研究中初步探討了HGF對多柔比星誘導的心肌細胞凋亡有明顯的保護作用［4］。相反，TGF-β1能促進心肌細胞的凋亡［5］，而通過抑制MSCs中TGF-β1的表達，能顯著降低多柔比星誘導的心肌細胞凋亡率。在前期研究結果的基礎上，我們設想HGF對心肌細胞的保護作用除了直接抑制細胞凋亡外，是否會抑制MSCs分泌TGF-β1呢？

本實驗通過轉染siRNA，從后轉錄水平抑制MSCs中HGF的表達，觀察MSCs旁分泌因子對多柔比星誘導的H9C2細胞凋亡的影響并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

4～6周齡SD大鼠，由江蘇大學實驗動物中心提供［實驗動物許可證號：SYXK（蘇）2008－0024］。H9C2細胞株購于中國科學院上海細胞庫。

鹽酸多柔比星購自美國Enzo公司；HGF-siRNA由上海吉瑪公司設計并合成；大鼠HGF、TGF-β1ELISA試劑盒購自上海奇康生物科技公司；兔抗大鼠HGF-IgG購自美國Santa Cruz公司，兔抗大鼠TGF-β1-IgG、GAPDH-IgG、山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；eECL高靈敏度化學發光檢測試劑盒購自北京康為世紀生物技術有限公司；AnnexinⅤ／PI雙染凋亡試劑盒購自南京厚載生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠原代MSCs的分離和培養 頸椎脫臼法處死大鼠，取出雙側股骨和腓骨并顯露骨髓腔。用5 mL注射器抽取無血清DMEM-F12沖洗骨髓腔。將收集的細胞懸液過濾、離心，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEF-F12重懸細胞，以107／mL密度接種于10 cm培養皿，置于培養箱中培養。待細胞融合達80%～90%時進行首次傳代培養。取培養至第3代的MSCs用于后續實驗。

1.2.2 H9C2細胞的培養 將H9C2細胞株以107／mL細胞密度接種于10 cm培養皿后置于培養箱中培養。待細胞達80%～90%融合時以1∶2傳代培養。

1.2.3 MSCs siRNA轉染方法 轉染前1天將第3代MSCs以2×104／mL的密度接種到6孔板中繼續培養。次日，待細胞融合達70%～80%，取HGF-siRNA稀釋液2μL于EP管中，加入200μL無血清的DMEM-F12混勻。取Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑5μL，加入250μL DMEM-F12培養基混勻后室溫下孵育5 min。將以上兩種液體混勻后室溫下孵育20 min，再重新接種到6孔板中，加入1 550μL無血清的DMEM-F12培養基，混勻后置于CO2培養箱中繼續培養。12 h后換為含10%血清的DMEM-F12培養，24 h后熒光電子顯微鏡下觀察轉染效率，并收集上清及細胞進行后續試驗。

1.2.4 MSCs與H9C2細胞共培養

1.2.4.1 H9C2細胞多柔比星損傷模型的建立取H9C2細胞懸液，每孔2 mL加入到30 mm共培養插件Millicell裝置中，置于培養箱中預培養48 h。用終濃度為1μmol／L的多柔比星處理4 h，建立多柔比星損傷模型，更換為含 10%血清的DMEM-F12。

1.2.4.2 轉染MSCs 將第3代MSCs按2×105／mL接種于6孔板中，24 h后分為未轉染組，轉染HGF-siRNA組及轉染陰性對照（NC）-siRNA組，繼續培養24 h。

1.2.4.3 建立MSCs與H9C2細胞共培養體系 將接種有H9C2細胞的Millicell裝置插入預先接種有MSCs的6孔板中，建立兩種細胞非直接接觸式的共培養體系。共分為4組：單獨H9C2細胞培養組、與MSCs共培養組、與HGF-siRNA-MSCs共培養組及與NC-siRNA-MSCs共培養組。

1.2.5 ELISA法檢測細胞上清HGF及TGF-β1含量

轉染成功后收集各組細胞上清液，按ELISA試劑盒操作說明加入適量標準品及樣品、檢測抗體、底物及終止液。酶標儀檢測各孔光密度值，根據標準曲線計算各組細胞上清中HGF及TGF-β1的質量濃度。

1.2.6 蛋白質印跡法檢測HGF及TGF-β1的相對表達量 MSCs轉染siRNA 24 h后加入細胞裂解液與PMSF的混合液體，40 min后吸取裂解液，4℃12 000 r／min離心20 min，吸取上清。取等蛋白含量的樣品上樣。恒壓80 V電泳約30min后提高電壓至110 V。80 V恒壓下4℃轉膜2 h。室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入相應的一抗（HGF稀釋濃度為1∶800，TGF-β1、GADPH稀釋濃度為1∶1 000），4℃過夜孵育。次日用HRP標記的二抗（稀釋濃度均為1∶10 000）室溫下孵育1 h。洗膜后加入eECL顯色液，用Bio-Rad凝膠成像儀掃描拍攝蛋白條帶，測定各條帶灰度值，并以GAPDH為參照，計算和分析結果。

1.2.7 流式細胞術AnnexinⅤ／PI雙染法檢測H9C2細胞凋亡率 吹打各組Millcell膜上的H9C2細胞，離心后收集細胞至Ep管中，用PBS洗滌細胞2次。各組分別加入結合緩沖液500μL混勻懸浮細胞，加入Annexin V-FITC 5μL避光反應，再加入PI 10μL避光4℃孵育5 min，流式細胞儀檢測分析。以AnnexinⅤ（＋）／PI（－）、AnnexinⅤ（＋）／PI（＋）兩個象限的細胞比例之和作為凋亡率。

1.3 統計學處理

使用SPSS 19.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差（±s）表示，重復測量資料采用一般線性模型方差分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SD大鼠MSCs的形態

MSCs懸液接種24 h后在電子顯微鏡下觀察，細胞開始貼壁生長。換液后可見貼壁的MSCs呈梭形或不規則形，單個或片狀生長。繼續培養3～5 d后，貼壁細胞呈明顯的細胞集落，呈漩渦狀分布。傳代后，細胞形態較均一，呈長梭形，為纖維樣細胞外觀。傳至第3代時，細胞形態較穩定。見圖1。

2.2 H9C2細胞形態

培養3 d的H9C2細胞呈長梭形，胞質豐富，折光度好。見圖2。

2.3 HGF-siRNA轉染MSCs的效率

HGF-siRNA轉染24 h后，熒光電子顯微鏡下計算綠色熒光細胞所占比例，顯示MSCs的轉染效率可達（75.46±3.36）%。見圖3。

圖1 第3代骨髓間充質干細胞（倒置顯微鏡×200）

圖2 H9C2細胞形態（倒置顯微鏡×200）

圖3 轉染HGF-siRNA的MSCs形態（熒光電子顯微鏡×200）

2.4 各組MSCs上清中HGF及TGF-β1含量

與未轉染組比較，轉染HGF-siRNA后的MSCs上清中的HGF含量明顯下降，而TGF-β1含量卻明顯增加，見表1。

表1 各組M SCs上清中HGF、TGF-β1的含量

2.5 各組MSCs中HGF及TGF-β1的表達量

提取各組細胞蛋白，用蛋白質印跡法檢測HGF及TGF-β1的表達量。轉染HGF-siRNA后的MSCs兩種旁分泌因子的表達量與細胞上清中檢測結果一致。見圖4－圖6。

圖4 蛋白質印跡法檢測各組MSCs旁分泌因子的表達

2.6 各組H9C2細胞的凋亡率

流式細胞術分析結果顯示，單獨培養的H9C2細胞凋亡率為（19.39±0.17）%，與MSCs共培養組為（6.65±0.4）%，與HGF-siRNA-MSCs共培養組為（18.54±0.64）%，與NC-siRNA-MSCs共培養組為（9.70±1.62）%。與HGF-siRNA-MSCs共培養24 h后的H9C2細胞凋亡率較與未轉染的MSCs共培養組及NC-siRNA-MSCs共培養組H9C2細胞凋亡率均明顯增加（P均＜0.05），但較H9C2單獨培養組細胞凋亡率下降（P＜0.05）。見圖7。

圖5 各組MSCs中HGF的表達

圖6 各組MSCs中TGF-β1的表達

圖7 流式細胞術檢測各組H9C2細胞的凋亡率

3 討論

MSCs作為一種多功能分化的干細胞，已被廣泛應用于心臟疾病的治療。近年來，旁分泌機制在其中的作用越來越受到重視。已發現的MSCs旁分泌細胞因子有40余種，其可能作用機制包括血管生成、抑制心肌細胞的凋亡、抑制炎性反應等［6］。

然而，大多研究都是針對單個因子的作用機制，在旁分泌細胞因子的微環境中，各因子間是否存在著相互作用呢？Kelly等［7］研究發現，腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor type 1，TNFR1）通過減少MSCs的旁分泌途徑而削弱MSCs對心肌細胞的保護作用。Jayasankar等［8］研究表明，HGF可通過促進新生血管的生成和抑制心肌細胞的凋亡對心肌梗死后的心臟起修復作用。

我們的實驗結果顯示，轉染HGF-siRNA的MSCs中HGF的表達量較未轉染組及陰性對照組均明顯下降，表明轉染模型構建成功。在HGF表達量減少的同時，發現TGF-β1的表達量與HGF呈相反趨勢。這一結果表明，MSCs旁分泌因子HGF對TGF-β1有抑制作用。

此外，本實驗采用Millicell裝置建立MSCs與多柔比星損傷的H9C2細胞的非直接接觸式共培養體系，保證MSCs旁分泌的各種細胞因子可以對H9C2細胞產生生物學影響。共培養24 h后采用流式細胞術AnnexinⅤ／PI雙染法檢測H9C2細胞凋亡率。結果顯示，與HGF-siRNA-MSCs共培養24 h后，H9C2細胞凋亡率較與未轉染的MSCs共培養組及NC-siRNA-MSCs共培養組H9C2細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05），但較H9C2單獨培養組細胞凋亡率下降（P＜0.05）。這一結果證實了MSCs旁分泌HGF抑制多柔比星誘導的H9C2細胞凋亡作用的機制不僅與HGF本身對細胞凋亡的保護作用有關，還與其對TGF-β1的抑制作用密切相關。

綜上所述，MSCs旁分泌作用對多柔比星誘導的H9C2細胞損傷的修復作用除了眾多對細胞有保護作用的旁分泌因子外，細胞因子間的相互作用在其中也起到了至關重要的作用。這一實驗結果啟迪我們，在研究MSCs旁分泌機制時，應將所形成的修復微環境看作一個整體，既研究各個旁分泌因子的單獨作用機制，也要注意發現因子間的相互作用，這樣才能更透徹地了解其機制，從而可通過抑制或促進某些旁分泌因子的表達而減少副效應、提高移植安全性，使旁分泌的微環境能極大地發揮對心肌細胞的修復作用。

［1］ Nakamura Y，Wang XV，Xu C，et al.Xenotransplantation of long-term-cultured swine bonemarrow-derived mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2007，25（3）：612－620.

［2］ Gnecchi M，Zhang Z，Ni A，et al.Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy［J］.Circ Res，2008，103（11）：1204－1219.

［3］ Bujak M，Ren G，Kweon HJ，et al.Essential role of Smad3 in infarct healing and in the pathogenesis of cardiac remodeling［J］.Circulation，2007，116（19）：2127－2138.

［4］ 郭俊芳，張贏予，陳蓉，等.骨髓間充質干細胞旁分泌途徑與阿霉素損傷心肌細胞凋亡：怎樣證明其一直效應？［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（10）：1755－1759.

［5］ 陳星，潘建業，周艷芳，等.轉化生長因子-β1在多柔比星致大鼠心肌細胞凋亡中的促進作用［J］.江蘇大學學報：醫學版，2012，22（1）：46－50.

［6］ Angoulvant D，Ivanes F，Ferrera R，et al.Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury［J］.J Heart Lung Transplant，2011，30（1）：95－102.

［7］ Kelly ML，Wang M，Crisostomo PR，et al.TNF receptor 2，not TNF receptor 1，enhances mesenchymal stem cell-mediated cardiac protection following acute ischemia［J］.Shock，2010，33（6）：602－607.

［8］ Jayasankar V，Woo YJ，Bish LT，et al.Gene transfer of hepatocyte growth factor attenuates postinfarction heart failure［J］.Circulation，2003，108（suppl 1）：Ⅱ230Ⅱ236.

Effect of hepatocyte grow th factor on doxorubicin-induced H9C2 cells apoptosis

LIU Ling-ling，ZHAO Long，LIXiao-li，ZHANG Ying-yu，WANG Hao，ZHOU Yan-fang，ZHANGGuo-hui
（Department of Cardiology，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To investigate the effect of hepatocyte growth factor（HGF）on doxorubicin（DOX）-induced H9C2 cells apoptosis.M ethods：The third generation ofmesenchymal stem cells（MSCs）were divided into three groups：cultured alone，HGF-siRNA-MSCs and NC-siRNA-MSCs.The concentration of HGF and transforming growth factorβ1（TGF-β1）weremeasured with both ELISA and Western-blot kit.H9C2 cellswere exposed to 1.0μmol／L doxorubicin for 4 hours.Then they were divided into four groups：cultured alone，co-cultured with MSCs，co-cultured with HGF-siRNA-MSCs and co-cultured with NC-siRNAMSCs.After 24 hours，the apoptosis rate was determined by flow cytometry（FCM）.Results：Compared with other groups，the concentration of TGF-β1in MSCs were significantly increased in the HGF-siRNAMSCs［（519.23±24.34）pg／mL］than cultured alone［（459.65±11.78）pg／mL］and NC-siRNA-MSCs［（459.33±11.78）pg／mL，P＜0.05］.The apoptosis rate of H9C2 cells was increased significantly in cocultured with HGF-siRNA-MSCs（18.54±0.64）%than co-cultured with MSCs（6.65±0.49）%and NC-siRNA-MSCs［（9.70±1.62）%，P＜0.05］.Conclusion：HGF prevented DOX-induced H9C2 cells apoptosis by inhibition of TGF-β1.

mesenchymal stem cells；paracrine；hepatocyte growth factor；transforming growth factor β1；apoptosis；doxorubicin

R329.2

A

1671－7783（2014）03－0221－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140033

劉玲玲（1988—），女，碩士研究生；張國輝（通訊作者），主任醫師，碩士生導師，E-mail：13338812776＠189.cn

2014－02－20 ［編輯］陳海林