siRNA抑制FANCF基因增加肺癌細胞對順鉑的敏感性

陳玉嬌，李堅，姜賀果，陳永昌

（1.江蘇大學附屬醫院呼吸內科，江蘇鎮江212001；2.江蘇大學基礎醫學研究所，江蘇鎮江212013）

siRNA抑制FANCF基因增加肺癌細胞對順鉑的敏感性

陳玉嬌1，李堅1，姜賀果1，陳永昌2

（1.江蘇大學附屬醫院呼吸內科，江蘇鎮江212001；2.江蘇大學基礎醫學研究所，江蘇鎮江212013）

目的：研究抑制FA／BRCA途徑中的范可尼貧血相關蛋白F（FANCF）基因在增加人肺腺癌CALU-1細胞株對順鉑敏感性中的作用。方法：設計靶向于FANCF基因的3條siRNAs（FANCF-siRNAs），用脂質體轉染試劑將其分別轉染于CALU-1肺癌細胞株，RT-PCR檢測轉染后24 h FANCFmRNA的變化；篩選轉染效率最高的siRNA片段。蛋白質印跡法檢測經順鉑處理的CALU-1細胞株轉染siRNA前后FANCF蛋白表達及FANCD2蛋白單泛素化水平；免疫熒光法測定胞核中FANCD2蛋白核聚小體的形成；CCK-8法測定轉染siRNA前后的細胞增殖率變化。結果：與轉染前比較，CALU-1肺癌細胞株轉染FANCF-siRNA后FANCF蛋白表達明顯下降，FANCD2蛋白單泛素化水平和核聚小體形成降低，細胞增殖率顯著下降。結論：應用siRNA轉染技術沉默FANCF基因可明顯增加肺癌細胞對順鉑的敏感性，提示在肺癌靶向治療策略中，FA／BRCA途徑中的FANCF基因很可能是一個潛在的分子靶標。

范可尼貧血相關蛋白F；FA／BRCA途徑；siRNA；順鉑；敏感性

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率呈逐年增長的趨勢。其中，非小細胞肺癌約占80%，主要為肺腺癌與肺鱗癌。順鉑（DDP）作為肺癌治療方案中的基本化療藥物，屬于廣譜細胞周期非特異性抗癌藥物，但其日益增強的腫瘤耐藥性限制了臨床應用。研究表明，DNA損傷修復能力是腫瘤細胞對DDP耐藥的重要分子基礎，通過沉默與DDP耐藥相關的基因進而抑制腫瘤細胞的DNA損傷修復能力，可增加腫瘤細胞對DDP的敏感性，逆轉耐藥狀態，從而提高肺癌化療效果，改善患者預后［1］。

近來的研究顯示，范可尼貧血癥（Fanconi anemia，FA）途徑在DNA交聯損傷的修復中發揮重要作用［2］。FA途徑受損可導致細胞染色體不穩定及對DNA損傷劑高度敏感。研究表明FA／BRCA途徑是細胞對DNA交聯劑引起的DNA交聯性損傷發生修復反應所必需的。FA途徑的核心蛋白是范可尼貧血相關蛋白D2（Fanconi anemia complementation group D2，FANCD2），上游是FA核心復合體，后者主要功能是單泛素化FANCD2，這一過程是BRCA1依賴性的，因此該途徑被稱為FA／BRCA途徑［3－4］。FANCD2在正常人體細胞中表現為兩個亞型：FANCD2-S和FANCD2-L。DNA交聯劑類化療藥物、紫外線和電離輻射可以激活FANCD2蛋白從相對分子質量為155 000的小片段（FANCD2-S）修飾為162 000的大片段（FANCD2-L），二者之比（L／S）反映FANCD2蛋白單泛素化水平［3］。FA／BRCA途徑的信號傳導中最關鍵事件是FANCD2的單泛素化，而范可尼貧血相關蛋白F（FANCF）是FA核心復合體的主要組成成分，在FANCD2的單泛素化過程中發揮著重要作用。FANCF蛋白低表達或功能缺陷會干擾FA／BRCA途徑的正常功能，進而參與腫瘤發生、發展及對交聯劑類化療藥耐藥性的形成。對卵巢癌、宮頸癌及神經膠質瘤的研究發現，部分腫瘤細胞FANCF基因啟動子甲基化所致的FANCF蛋白低表達可引起FANCD2單泛素化水平降低、FA／BRCA途徑功能被抑制，表現為腫瘤細胞對交聯劑類化療藥的敏感性增加［5－7］。抑制FANCF基因表達是否可增加肺癌細胞對DDP的敏感性，尚未見相關報道。

本實驗采用siRNA轉染技術觀察FANCF基因沉默對肺癌CALU-1細胞部分生物學特性的影響。通過比較siRNA轉染前后CALU-1細胞的FANCD2單泛素化水平和FANCD2核聚小體形成狀態，以及細胞增殖率變化，探討通過沉默FANCF基因而下調FA／BRCA途徑功能，以增加肺癌CALU-1細胞株對DDP敏感性的可行性及效應。

1 材料與方法

1.1 材料

非小細胞肺癌細胞株（CALU-1）購自中國科學院上海生命科學研究院；DDP購自江蘇豪森制藥有限公司；胎牛血清、高糖DMEM購自美國Gibco公司；siRNA套裝購自廣州銳博生物科技有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒，Trizol購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；二甲基亞砜，Triton X-100購自美國Sigma公司；β-肌動蛋白，FANCF蛋白抗體，FANCD2蛋白抗體購自美國Santa Cruz公司；低聚甲醛，羊抗小鼠二抗，CY3熒光標記羊抗鼠二抗購自北京康為世紀公司；ECL發光劑購自美國Millipore公司；PVDF膜，牛血清白蛋白（BSA）購自瑞士Roche公司；DAPI購自美國Beyotime公司；反轉錄試劑盒購自美國Fermentas公司；熒光定量試劑盒購自日本Toyobo公司。

靶向于FANCF基因的3條siRNAs序列（FANCF-siRNAs）由廣州銳博生物科技有限公司設計合成。siRNA-1序列：上游，5′-GGUCAACGUUUGCACUAUGDTDT-3′，下游，5′-CAUAGUGCAAACGUUGACCTDTD-3′；siRNA-2序列：上游，5′-GUACCUGGUCUUAGCAUCUDTDT-3′，下游，5′-AGAUGCUAAGACCAGGUACTDTD-3′；siRNA-3序列，上游，5′-CUUCGUAGUG GUGCAUUUADTDT-3′，下游，5′-UAAA UGCACCACUACGAAGTDTD-3′。

引物由上海生工生物工程有限公司設計合成。GAPDH引物序列：上游，5-TCCAAAATCAAGTGGGGCGA-3′，下游，5′-TGATGACCCTTTTGGCTCC-3′；FANCF基因引物序列：上游，5′-TGCTAACAGACTGGGGTCAAC-3′，下游，5′-TACAGGTCTCCAGGGCAGTTA-3′。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 CALU-1細胞株置于含10%熱滅活胎牛血清、青霉素（100 U／mL）、鏈霉素（100 μg／mL）的DMEM中，于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中孵育。

1.2.2 篩選轉染效率最高的siRNA片段 將對數生長期的CALU-1細胞接種于6孔板，1×106／孔。培養12 h后換用無血清培養基饑餓12 h。實驗分6組，分別為空白對照組、陰性對照siRNA組、陽性對照siRNA組（GAPDH-siRNA），以及3個實驗組（分別為siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組）。siRNA轉染濃度為50 nmol／L。按照siRNA試劑盒說明書，將LipofectamineTM2000與FANCF-siRNA儲存液各5 μL分別溶于250μL不含抗生素的無血清DMEM中，室溫孵育5 min。輕搖混勻LipofectamineTM2000與siRNA儲存液，室溫孵育20 min后，加入培養板中，培養基終體積為2 mL。轉染6 h后，換用含10%胎牛血清的DMEM繼續培養。轉染24 h后行RT-PCR檢測各組細胞FANCF mRNA水平，實驗重復3次。

1.2.3 蛋白質印跡法檢測肺癌細胞FANCF和FANCD2蛋白表達 在3個實驗組中選擇轉染效率最高的siRNA-2片段轉染肺癌CALU-1細胞株，取對數生長期轉染成功前、后的CALU-1細胞接種于6孔板，2.5×106／孔，培養24 h。經含DDP質量濃度分別為0、2.5、5、10、20μg／mL的2 mL培養基處理24 h，棄培養基，預冷PBS洗2次，加入煮沸的2× SDS上樣緩沖液100μL，收集細胞總裂解物，100℃煮沸5 min，超聲破碎1 min，12 000×g，4℃離心5 min。將蛋白樣品行8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉印至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。一抗鼠抗人FANCF單克隆抗體（1∶100）、鼠抗人FANCD2單克隆抗體（1∶200）4℃孵育過夜。二抗羊抗鼠IgG（1∶2 000）室溫孵育1 h，β-肌動蛋白（1∶10 000）室溫孵育1 h。ECL發光劑顯色，Typhoon分子成像系統分析灰度，以FANCF／β-肌動蛋白、FANCD2／β-肌動蛋白比值表示FANCD2蛋白的相對含量，L／S比值反映FANCD2蛋白單泛素化水平，實驗重復3次。

1.2.4 免疫熒光法檢測FANCD2核聚小體表達在3個實驗組中選擇轉染效率最高的siRNA-2片段轉染肺癌CALU-1細胞株，取對數生長期轉染成功前、后的CALU-1細胞接種于24孔板，5×105／孔。設空白培養組，每組3個復孔，培養24 h，5μg／mL DDP處理24 h，PBS洗2次；每孔200μL 4%低聚甲醛固定細胞20 min，PBS洗30 min；300μL 0.3% Triton X-100透膜作用40 min，PBS洗30 min；500 μL 3%BSA室溫孵育1 h，PBS洗30 min；200μL FANCD2一抗4℃過夜，PBS洗15 min；熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBS避光洗15 min；DAPI染核10 min，PBS暗處洗15 min；熒光顯微鏡下觀察熒光強度，實驗重復3次。

1.2.5 CCK-8法測定細胞增殖率 在3個實驗組中選擇轉染效率最高的siRNA-2片段轉染CALU-1細胞株，取對數生長期轉染成功前后的CALU-1細胞接種于96孔板中，2.0×103／孔，培養24 h，將一系列含DDP質量濃度分別為0、1.25、2.5、5、10、20 μg／mL的培養基100μL分別加入對應的孔，其中0 μg／mL為陰性對照組，同時設立空白孔（只含培養基）進行校正，每組樣本6個復孔。分別培養24、48 h后，于對應孔加入CCK-8試劑10μL，繼續培養1 h。酶標儀450 nm波長下檢測各孔的光密度（D）值。細胞增殖率＝［（D實驗組－D空白孔）／（D陰性對照組－D空白孔）×100%，實驗重復3次。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 篩選沉默效率最高的siRNA片段

空白對照組、陰性對照siRNA組、陽性對照siRNA組、siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組的FANCF mRNA表達水平分別為1.09±0.04、1.15±0.07、2.67±0.19、0.98±0.06、0.54±0.04和1.02± 0.05，結果顯示干擾效率最高的為實驗組中siRNA-2序列（F＝58.248，P＜0.05），其siRNA轉染后的細胞基因沉默率約達50.5%。見圖1。選擇轉染效率最高的siRNA-2進行下一步實驗。

圖1 siRNAs轉染CALU-1細胞后電泳結果

2.2 FANCF-siRNA轉染前后肺癌細胞FANCF蛋白表達及FANCD2單泛素化水平

經FANCF-siRNA轉染后CALU-1細胞的FANCF蛋白較陰性對照組及空白對照組明顯減少（t分別為－5.487，－6.251，P均＜0.05），而陰性對照組與空白對照組比較，差異無統計學意義（t＝ 0.081，P＞0.05），表明FANCF-siRNA轉染有效。見圖2。

經FANCF-siRNA轉染的CALU-1細胞，除20 μg／mL DDP處理24 h后的L／S比值與轉染前差異無統計學意義外，其余各質量濃度處理24 h后的FANCD2蛋白總量及L／S比值均較轉染前明顯降低（P均＜0.05），表明FANCD2單泛素化水平顯著降低。見圖3。

2.3 FANCF-siRNA轉染前后肺癌細胞FANCD2核聚小體表達

免疫熒光檢測結果顯示，CALU-1細胞經5μg／mL DDP處理24 h和48 h后，胞核內FANCD2核聚小體表達增強（核聚小體形成）；CALU-1細胞轉染FANCD2-siRNA后，經5μg／mL DDP處理24 h后胞核內FANCD2核聚小體表達降低。見圖4。

圖2 FANCF-siRNA轉染前后CALU-1細胞株FANCF蛋白表達

圖3 FANCF-siRNA轉染前后CALU-1細胞株FANCD2單泛素化水平（L／S比值）

圖4 FANCD2核聚小體（箭頭示）表達情況

2.4 轉染FANCF-siRNA后順鉑對CALU-1細胞株增殖的抑制作用

CALU-1細胞株轉染FANCF-siRNA 24 h和48 h后，IC50較轉染前均顯著降低（P均＜0.05）。見表1。

轉染FANCF-siRNA前后的CALU-1株細胞增殖率均隨DDP質量濃度的增高而降低，呈劑量依賴性，每個時間點不同濃度組之間增殖率差異均有統計學意義（P均＜0.05）。FANCF-siRNA轉染后，CALU-1株細胞增殖率在順鉑處理24 h和48 h時間點低于其siRNA轉染前（P均＜0.05）。見圖5。

表1 siRNA轉染前后CALU-1肺癌細胞經順鉑處理后的IC50 μg／m L

3 討論

FA／BRCA途徑主要在細胞周期的S期被激活，在交聯劑類化療藥物（如DDP）引起細胞DNA損傷的修復過程中發揮重要作用。激活初始是FA／BRCA途徑上游蛋白（如FANCA、FANCB、FANCC、FANCE、FANCF等）形成FA核心復合體，然后FANCD2與FANCDI在FA核心復合體及泛素化結合酶（E2）等蛋白的作用下發生單泛素化，形成復合物ID，并與BRCA1，BRCA2，RAD51及ATR等相互作用，在DNA損傷部位共定位形成核聚小體，進而激活FA／BRCA途徑下游蛋白，與其他DNA修復途徑（如同源重組修復途徑、核苷酸切除修復途徑）相互作用，從而啟動對細胞DNA交聯性損傷的修復并對DDP等交聯劑產生抵抗［8－11］。研究發現，在頭頸部癌細胞中，DDP敏感細胞株FANCD2單泛素化水平明顯降低，而DDP耐藥細胞株FANCD2泛素化水平正常，抑制FA／BRCA途徑上游蛋白從而下調FANCD2單泛素化水平可顯著增強頭頸部癌細胞對DDP、奧沙利鉑的敏感性［12－13］。應用選擇性FA／BRCA途徑抑制劑（如姜黃素等）在體外分別處理宮頸癌細胞、卵巢癌細胞、乳腺癌細胞和骨髓瘤細胞，可明顯增強其對DNA交聯劑類抗癌藥物的敏感性［14－16］，說明完整的FA／BRCA途徑功能狀態在腫瘤細胞對DNA交聯劑類抗癌藥物的耐藥機制中起重要作用，損害或抑制FA／BRCA途徑功能可增強腫瘤細胞對DNA交聯劑類抗癌藥物的敏感性。

圖5 FANCF-siRNA轉染CALU-1細胞增殖率的劑量 效應曲線與時間 效應曲線

FANCF作為FA／BRCA途徑的重要調控蛋白，位于該途徑上游，通過N端與FANCC／FANCE亞單位相互作用，通過C端與FANCF／FANCG亞單位相互作用，發揮穩定FA復合體的作用。FANCD2在 FA復合體的作用下發生單泛素化，這是FA／BRCA途徑信號傳導過程中最關鍵的事件，而FANCF是激活FANCD2單泛素化的關鍵因子，因此，FANCF是FA／BRCA途徑生物學功能所必需的重要蛋白。FANCF基因表達下降或缺失會導致FA／BRCA信號轉導途徑缺陷、細胞染色體不穩定以及對DNA交聯性損傷劑高度敏感［17－19］。He等［6］研究顯示，采用siRNA技術沉默卵巢癌OVCAR3細胞的FANCF基因可降低FANCF、FANCD2蛋白的表達和FANCD2單泛素化水平，增加OVCAR3細胞對阿霉素的敏感性，表明沉默FANCF基因能抑制卵巢癌OVCAR3細胞的FA／BRCA途徑功能從而逆轉細胞對阿霉素的耐藥性。Li等［7］研究也顯示沉默乳腺癌MCF-7細胞的FANCF基因可降低FANCD2單泛素化水平，抑制乳腺癌MCF-7細胞的FA／BRCA途徑功能從而增加其對米托蒽醌（mitoxantrone）的敏感性。

本實驗室之前的研究已經證明肺癌細胞株CALU-1對DDP的耐藥性明顯高于肺癌A549細胞［20］，故本實驗選擇對DDP耐藥性較高的CALU-1細胞，采用siRNA轉染技術沉默FANCF基因，通過觀察FANCF基因沉默前后FANCD2單泛素化水平和FNACD2核聚小體形成狀態，以及細胞增殖率變化，探討應用轉染技術沉默FANCF基因，抑制FA核心復合體形成后增加肺癌細胞株CALU-1對順鉑敏感性的可行性及效應。結果顯示，轉染FANCF-siRNA的CALU-1細胞，經DDP處理后，FANCF蛋白表達明顯下降，證實轉染成功，FANCD2單泛素化水平及FANCD2核聚小體表達均降低，反映FA／BRCA途徑上游蛋白被激活并已行使單泛素化功能，CALU-1細胞的IC50及細胞增殖率顯著降低，表明對DDP敏感性明顯增強。最終證明，應用siRNA轉染技術抑制FA／BRCA途徑上游的FANCF基因可顯著增加腫瘤細胞對DDP的敏感性。

綜上所述，FANCF基因沉默能夠抑制肺癌CALU-1細胞株FA／BRCA途徑的DNA修復功能，逆轉CALU-1細胞株對DDP的耐藥性。FANCF有可能成為肺癌分子靶向治療策略中增強肺癌細胞對交聯劑類抗癌藥物敏感性的新靶點。

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Silencing of FANCF gene by siRNA interference sensitizes lung cancer CALU-1 cells to cisplatin

CHEN Yu-jiao1，LIJian1，JIANG He-guo1，CHEN Yong-chang2
（1.Departmentof Pulmonary Medicine，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Institute of BasalMedicine Science，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To examine whether silencing of FANCF gene by siRNA interference technique could sensitize lung adenocarcinoma CALU-1 cell line to cisplatin（DDP）.M ethods：Three siRNAs targeted to FANCF（FANCF-siRNAs）were designed and synthesized.After separately transfected into CALU-1 cells，the RT-PCR was used to determine the expression of FANCF mRNA，the siRNA with the highest transfection efficiency was selected.Western Blotting was carried out to detect the expression of FANCF protein，and the levels of FANCD2 protein monoubiquitination，which was defined by the radio ofmonoubiquitination-FANCD2（L）and non-monoubiquitination-FANCD2（S），in CALU-1 cells treated with cisplatin before and after FANCF-siRNA transfection.Immunofluorescence assay was performed to determine the formation of FANCD2 nuclear foci.CCK-8 technique was used to measure the cell proliferation rate of CALU-1 cells treated with DDP pre-and post-transfection of FANCF-siRNA.Results：After transfection of FANCF-siRNA，we found that silencing of FANCF gene decreased the levels of FANCD2 monoubiquitination（L／S ratio），and nuclear foci formation of FANCD2 in CALU-1 cells.Meanwhile，silencing of FANCF gene significantly decreased the cell proliferation rate in CALU-1 cells treated with DDP（both P＜0.05）.Conclusion：Silencing of FANCF gene by FANCF-siRNA transfection could potentiate the sensitivity to cisplatin in CALU-1 cells，suggesting that FANCF genemay be a potential target in therapeutic strategies for the treatment of lung cancer.

FANCF；FA／BRCA pathway；siRNA；cisplatin；sensitivity

陳玉嬌（1987—），女，碩士研究生；李堅（通訊作者），教授，主任醫師，博士生導師，E-mail：lijian541226＠163.com

R392.28；R979.1

A

1671－7783（2014）03－0195－06

10.13312／j.issn.1671-7783.y140014

2014－01－24 ［編輯］ 劉星星