低溫凍存對人脂肪間充質干細胞生物學特性的影響

李興天，李小戰，馬紅，許輝，李淑，李遇梅

（江蘇大學附屬醫院皮膚科，江蘇鎮江212001）

低溫凍存對人脂肪間充質干細胞生物學特性的影響

李興天，李小戰，馬紅，許輝，李淑，李遇梅

（江蘇大學附屬醫院皮膚科，江蘇鎮江212001）

目的：比較人脂肪間充質干細胞（human adipose-derived mesenchymal stem cells，hADSCs）凍存前和復蘇后的生物學特性，為今后建立低溫干細胞庫提供實驗支持。方法：采用0.1%Ⅰ型膠原酶消化法從腹部大網膜脂肪組織中分離hADSCs，體外培養擴增，將處于均一穩定生長狀態的第3代hADSCs置于液氮中分別凍存1、3和6個月，復蘇后臺盼藍染色檢測細胞存活率，采用MTT法繪制細胞生長曲線，流式細胞術檢測細胞表面抗原，成脂成骨誘導后鑒定多向分化能力，RT-PCR檢測成脂特異性基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ-2（peroxisome proliferator-activated receptorγ-2，PPARγ-2）和成骨特異性基因骨鈣素（osteocalcin，OC）的表達情況。結果：隨凍存時間的延長細胞存活率略有下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）。MTT結果顯示凍存前后細胞增殖能力均很強。流式細胞檢測結果顯示凍存前后細胞均高表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，低表達CD45和HLA-DR。凍存前后hADSCs均具有向脂肪細胞和骨細胞分化潛能，且RT-PCR結果顯示，PPARγ-2和骨鈣素mRNA的表達凍存前后差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論：經液氮凍存后的hADSCs具有高存活率，生物學特性保持穩定且仍具有多向分化潛能。

人脂肪間充質干細胞；凍存；生物學特性；干細胞庫

脂肪間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）是來源于脂肪組織的間充質干細胞，由于取材方便、對機體損傷小且易于體外培養，已在再生醫學研究中受到廣泛關注。近期有研究顯示，hADSCs免疫原性低，不表達HLAⅡ類抗原且能調節T淋巴細胞的活性［1］，可以用于移植物抗宿主反應或自身免疫性疾病的治療。將ADSCs低溫保存，就可以在患者需要的時候進行同種同體或同種異體細胞移植，挽救患者生命。本研究將第3代ADSCs置于液氮中分別保存1、3和6個月，初步探討低溫凍存對人ADSCs生物學特性的影響，為今后建立低溫干細胞庫提供實驗支持。

1 材料與方法

1.1 標本采集

脂肪組織取自2013年在江蘇大學附屬醫院產科接受手術的7例產婦腹部大網膜，產婦年齡17～33歲，平均26歲。患者對實驗知情同意，且實驗經醫院倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器

低糖-DMEM、高糖-DMEM（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），Ⅰ型膠原酶（Gibco公司），噻唑藍、胰蛋白酶（Amresco公司），鼠抗人單克隆抗體CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其相應同型對照（eBioscience公司），地塞米松、抗壞血酸磷酸鹽、β-甘油磷酸鈉、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素（Sigma公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），反轉錄試劑盒、SYBR-PCR試劑盒（TaKaRa公司），酶聯免疫檢測儀（Clinibio公司），流式細胞儀（BD公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 hADSCs的分離和培養 外科無菌條件下取出脂肪組織約10 mL，PBS吹打清洗3次，盡量去除脂肪表面的結締組織和血管，剪成1 mm×1 mm× 1 mm的組織塊，加入2倍體積0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃水浴消化45 min，期間每5 min取出劇烈震蕩，加入含10%胎牛血清低糖-DMEM終止消化，1 500 r／min離心10 min，去除上層漂浮的脂肪組織，沉淀重懸，200目細胞篩過濾，再離心。加入完全培養液（含10%胎牛血清、100 U／mL青霉素、100 mg／mL鏈霉素的低糖DMEM）重懸、接種，置于37℃，5% CO2培養箱中培養，24 h后首次換液，之后每周換液2次，待細胞生長至80%融合時，以0.25%胰酶0.02%EDTA消化傳代。

1.3.2 hADSCs的凍存和復蘇 當處于均一穩定生長狀態的第3代hADSCs生長至80%融合時，用0.25%胰酶 0.02%EDTA消化液消化，離心棄上清，加入凍存液（含10%DMSO、90%胎牛血清），調整細胞終密度為1×106／mL，分裝于凍存管中。經4℃30 min→－20℃2 h→－70℃過夜→液氮。分別于凍存1個月、3個月和6個月后取出凍存管，置于37℃恒溫水浴箱內，并不斷搖動以促進融化。將細胞懸液轉至離心管中，加入10倍體積的完全培養液離心棄上清，再重懸于完全培養液，待細胞達到80%融合時，常規消化傳代。

1.3.3 細胞存活率檢測 復蘇后，取出部分細胞懸液按1∶1與0.4%臺盼藍溶液混勻1min，采用血細胞計數板計數法，光鏡下計數被染成藍色的死細胞數和未染的活細胞數。細胞存活率（%）＝（活細胞數／細胞總數）×100%。

1.3.4 MTT法繪制細胞生長曲線 取凍存前及復蘇后的第5代hADSCs，用培養液制成2×104／mL細胞懸液，接種于96孔板，每孔200μL。自第2天起，每天固定時間取1塊96孔板，于各孔內加入5 mg／mLMTT 20μL，置于37℃恒溫培養箱中孵育4 h后吸去上清，每孔加入150μL二甲基亞砜，搖床振蕩10 min。酶聯免疫檢測儀上490 nm波長處讀出光密度（D）值。連測8 d，以光密度值為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞生長曲線。

1.3.5 細胞免疫表型檢測 消化收集凍存前及復蘇后的第5代hADSCs，1 000 r／min離心5 min，用PBS重懸分裝于1.5 mL的EP管中，每管100μL，細胞密度為105／mL，加入鼠抗人單克隆抗體CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其同型對照IgG2a-FITC、IgG1-PE。4℃避光孵育30 min，PBS洗2次，加PBS 300μL重懸后采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原。

1.3.6 成脂成骨分化鑒定 取凍存前及復蘇后的第5代hADSCs接種于6孔板中，待達到80%融合時，分別改用成脂誘導培養液（含10%胎牛血清、0.5 mmol／L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1μmol／L地塞米松、10μmol／L胰島素、200μmol／L吲哚美辛的高糖DMEM）和成骨誘導培養液（含10%胎牛血清、0.1μmol／L地塞米松、50μmol／L抗壞血酸磷酸鹽、10 mmol／Lβ-甘油磷酸鈉的高糖DMEM）誘導2周，每周換液2次，對照組加完全培養液。2周后分別用油紅O［2］和von Kossa染色［3］鑒定脂滴和鈣結節。1.3.7 RT-PCR檢測成脂特異性基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ-2（PPARγ-2）和成骨特異性基因骨鈣素的表達 取凍存前及復蘇后的第5代hADSCs接種于6孔板中，待達到80%融合時，分別改用成脂誘導培養液和成骨誘導培養液誘導1周，換液2次，對照組加完全培養液。使用Trizol法提取對照組、成脂組及成骨組的RNA作為模板進行反轉錄，最后按照RT-PCR試劑盒說明書對PPARγ-2及骨鈣素進行擴增，以β-肌動蛋白為內參，結果用2－ΔΔCt法換算。擴增基因引物序列見表1。

表1 擴增基因引物序列

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 hADSCs分離培養

hADSCs原代培養48 h后，可見散在貼壁細胞，于第7至第8天細胞融合至80%～90%傳代，當傳至第3代，細胞生長形態均一，呈放射狀、河流狀的梭形細胞（圖1）。

2.2 hADSCs凍存復蘇后的存活率

圖1 脂肪間充質干細胞形態（100×）

采用臺盼藍染色方法計數，第3代hADSCs經凍存1個月、3個月和6個月后，平均存活率分別為（95.39±3.09）%，（89.58±5.25）%和（85.39± 4.15）%，存活率隨凍存時間的延長略有下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 細胞生長曲線

生長曲線顯示第5代hADSCs凍存前及凍存1個月、3個月和6個月的增殖情況無明顯差異，均呈“S”形，在接種第3天進入對數生長期，第7天進入平臺期（圖2）。

圖2 凍存復蘇前后人脂肪間充質干細胞生長曲線

2.4 細胞免疫表型

凍存前及凍存1個月、3個月和6個月第5代hADSCs均高表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，低表達CD45和HLA-DR（圖3和表2），各時間段間表達率的差異無統計學意義。

表2 凍存復蘇前后人脂肪間充質干細胞表面抗原分布情況 %

圖3 凍存復蘇前后人脂肪間充質干細胞表面抗原表達

2.5 成脂成骨分化鑒定

凍存前和復蘇后hADSCs經2周成脂成骨誘導，油紅O染色可見成脂細胞內有較多鮮紅色脂滴，部分小脂滴融合成較大的脂滴，von Kossa染色可見黑褐色礦化鈣結節聚集（圖4），而對照組均為陰性。

圖4 凍存前和復蘇后hADSCs成脂成骨分化鑒定（×200）

2.6 PPARγ-2和骨鈣素mRNA的表達

凍存前及凍存1個月、3個月和6個月第5代hADSCs經成脂和成骨誘導1周后，PPARγ-2 mRNA的相對表達量分別為5.55±0.48，5.45±0.40，5.15±0.18和5.58±0.37，各時間點間的差異無統計學意義（F＝0.84，P＞0.05）；骨鈣素mRNA的相對表達量分別為1.27±0.13，1.38±0.11，1.25± 0.12和1.32±0.16，各時間點間的差異亦無統計學意義（F＝0.57，P＞0.05）。結果表明凍存與否以及凍存時間對兩種基因的表達量無明顯影響。

3 討論

干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞。Gimble等［4］提出干細胞在再生醫學上運用需滿足以下幾點：① 來源豐富；② 對機體損傷小；③具有多向分化潛能；④ 可安全有效地進行自體或同種異體移植；⑤ 可在良好作業規范指導下操作。脂肪組織完全滿足再生醫學的這些要求，如1 g脂肪組織可以產生接近5 000個干細胞，是1 g骨髓中間充質干細胞的500倍［5］。因此，ADSCs正成為比骨髓間充質干細胞更理想的干細胞來源。

最近有研究顯示，凍存1年的人臍帶血管內皮細胞生物學特性無明顯改變［6］。將抽脂術所得脂肪長期凍存于液氮，復蘇后提取的ADSCs細胞數量仍可達到新鮮組織的90%［7］。如將特定代數的ADSCs進行低溫液氮冷凍保存，在需要時復蘇，就可以由少量細胞傳代擴增獲得足夠的干細胞，為免疫性疾病和再生醫學治療提供良好的種子細胞。

細胞低溫凍存最大的挑戰是冷凍和融化復蘇對細胞膜的致死性破壞［8］。本研究中，我們使用二甲基亞砜（DMSO）保護細胞，在低溫環境下可以阻止細胞內冰晶的形成。采用緩慢的凍存過程（4℃30 min→－20℃2 h→－70℃過夜→液氮），復蘇時，37℃恒溫水浴箱內不斷搖動令其盡快融化，這一慢凍快融的方法可以盡量減少冰晶的形成從而避免細胞膜被破壞，提高了細胞存活率。實驗中，我們將凍存的細胞復蘇后，臺盼藍染色發現凍存6個月細胞存活率仍保持在80%以上且保持較高的增殖能力，證實慢凍快融是一種切實可行的凍存方法。

凍存前后一個重要的觀察指標是hADSCs表面分子標志，本實驗凍存復蘇后hADSCs均高表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，低表達CD45和HLA-DR，免疫表型符合MSCs的鑒定標準［9－10］。此外，在成脂成骨誘導條件下，凍存復蘇后hADSCs仍可表達脂肪細胞特異性基因PPARγ-2［11］和成骨細胞特異性基因骨鈣素［12］，且油紅和von Kossa染色也證實其多向分化能力保持不變。

值得思考的是，DMSO在常溫下具有毒性，因此復蘇的細胞需經洗滌和離心以盡可能除去或減少培養基中DMSO的濃度，能否找到一種無毒有效的凍存劑來替代DMSO，有待進一步的實驗探索。

本實驗不能確定凍存超過6個月后干細胞特性有無明顯變化，但單次液氮－196℃儲存6個月后，hADSCs具有高存活率，生物學特性保持穩定且仍具有多向分化潛能，為今后建立低溫干細胞庫提供了實驗支持。

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Effect of cryopreservation on biological characteristics of human adipose-derived mesenchymal stem cells

LIXing-tian，LIXiao-zhan，MAHong，XU Hui，LIShu，LIYu-mei
（Department of Dermatology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To provide the experimental support for establishing a low-temperature stem cell bank for future use，freeze-thawed human adipose-derived mesenchymal stem cells（hADSCs）were compared with fresh hADSCs in vitro.M ethods：The hADSCs were isolated from abdomen epiploica adipose tissue by collagenase digestion and subcultured in vitro.The third passage of hADSCswas cryopreserved in liquid nitrogen for 1，3，and 6 months.Cell viability，proliferation potential，expression of cellularmarkers and multipotential differentiation were studied after thawing using trypan blue staining，MTTmethod，flow cytometry analysis，Oil Red O staining，von Kossa，and RT-PCR.Results：After thawing，cell survival rate was found to descend as the time of cryopreservation prolonged.MTT revealed high capability for the proliferation.Phenotypic studies revealed that hADSCswere positive for CD29，CD44，CD73，CD90，CD105，CD166 and negative for CD45，and HLA-DR.Functional analysis demonstrated these cells could be differentiated into adipocytes and osteoblasts in lineage-specific medium.RT-PCR results proved that adipogenic and osteogenic related genes could be expressed.No significant difference（P＞0.05）was noted before and after the cryopreservation in cell viability，proliferation potential，expression of cellularmarkers and multipotential differentiation.Conclusions：The hADSCs could maintain acceptable viability，biological characteristics，and multipotential differentiation after cryopreservation.

human adipose-derived mesenchymal stem cells；cryopreservation；biological characteristics；stem cell bank

李興天（1987—），男，碩士研究生；李遇梅（通訊作者），副教授，碩士生導師，E-mail：drlymmg＠gmail.com

R329.2

A

1671－7783（2014）03－0190－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140070

國家自然科學基金資助項目（30972663）

2014－03－22 ［編輯］ 陳海林