靶向miR-126慢病毒表達載體的構建及意義

楊學藝，盧小東，邵啟祥，劉家秀，劉娟

（1.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212013；2.淮陰衛生高等職業技術學校檢驗藥學系，江蘇淮安223300；3.淮安市第四人民醫院檢驗科，江蘇淮安223001）

靶向miR-126慢病毒表達載體的構建及意義

楊學藝1，2，盧小東1，邵啟祥1，劉家秀2，劉娟3

（1.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212013；2.淮陰衛生高等職業技術學校檢驗藥學系，江蘇淮安223300；3.淮安市第四人民醫院檢驗科，江蘇淮安223001）

目的：檢測微小RNA-126（microRNA-126，miR-126）在CD4＋CD25＋調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs）中的表達水平，同時構建基于慢病毒的miR-126反義寡核苷酸序列（antisense oligonucleotides，ASOs）表達載體。方法：實時定量PCR特異性探針法檢測miR-126在Tregs中的表達水平；針對miR-126序列，設計合成其ASOs序列，退火后連接至經AgeⅠ酶和Eco RⅠ酶雙酶切的pGCsil-LV-GFP載體上，連接產物轉化DH5α感受態細胞，對經PCR鑒定為陽性的載體（命名為pGCsil-miR-126-ASOs）進行測序分析；將構建成功的pGCsil-miR-126-ASOs表達質粒和pHelper 1.0、pHelper 2.0質粒共轉染293T細胞，濃縮病毒顆粒并測定所獲病毒滴度；將制備好的病毒顆粒感染經TGF-β體外誘導培養的小鼠CD4＋CD62L＋初始T細胞，72 h后用流式細胞儀檢測其Foxp3的表達變化。結果：實時定量PCR結果顯示miR-126在CD4＋CD25＋Tregs中的表達明顯高于CD4＋CD25－T細胞（P＜0.01）；測序結果證明成功構建pGCsil-miR-126-ASOs重組質粒載體，包裝并獲得高濃度的慢病毒顆粒，病毒滴度為9×108TU／m L；重組的病毒能明顯抑制Tregs的外周誘導（P＜0.05）。結論：成功構建miR-126 ASOs的慢病毒表達載體，并獲得高濃度的病毒顆粒。

微小RNA-126；CD4＋CD25＋調節性T細胞；反義寡核苷酸；慢病毒

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一組內源性、長度在22～24 nt的非編碼單鏈小RNA分子，能在轉錄后水平通過促進靶mRNA的降解或抑制蛋白質翻譯來負調控靶基因的表達，從而參與調控細胞的發育、分化和功能［1－2］。近年來大量研究顯示，T細胞亞群具有不同的miRNAs表達譜，后者在不同亞群T細胞的發育、分化和功能維持中發揮了關鍵的調控作用［3－4］。

CD4＋CD25＋調節性T細胞（regulatory T cell，Tregs）是一群具有負向免疫調控抑制功能的CD4＋T細胞亞群，在維持機體免疫穩定的過程中發揮重要作用，其與其他亞群之間的失衡常常導致腫瘤的免疫逃逸、免疫耐受的打破和自身免疫性疾病的發生、發展［5］。外周血中的Tregs分為胸腺發育產生的nTregs（natural Tregs）和經誘導產生的iTregs（induced Tregs）兩類。體內微環境誘導產生的iTregs在臨床疾病如感染性疾病和腫瘤等發生過程中發揮重要作用，然而其誘導機制仍不明確。新近的研究表明，miRNAs與Tregs的發育和功能密切相關［6］。因此，分析特定的miRNAs分子與Tregs之間的關系將有助于揭示Tregs在外周微環境中被誘導的機制。

miR-126是近年來報道的miRNAs家族成員之一，在包括腫瘤在內的多種臨床疾病發生中發揮了重要作用［7］。新近的研究顯示，miR-126對于CD4＋T細胞的功能起了關鍵的調控作用［8］，然而，還未有報道其是否參與Tregs的外周誘導過程的研究。本研究擬先檢測Tregs中miR-126的表達水平，然后構建基于慢病毒的miR-126反義寡核苷酸序列（antisense oligonucleotides，ASOs）表達載體，并初步觀察miR-126 ASOs是否影響Tregs的外周誘導，以期為后續深入探討特定miRNAs分子在Tregs外周誘導過程中的作用及機制提供前期實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

慢病毒載體系統包括pGCsil-LV-GFP載體、pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體（GeneChem公司）；AgeⅠ、Eco RⅠ、T4DNA連接酶（美國NEB公司）；DH5α感受態細胞（本室保存），質粒抽提試劑盒（美國Promega公司），瓊脂糖凝膠回收試劑盒（碧云天生物技術公司），RPMI 1640培養基（美國Hyclone公司），胎牛血清（北京索萊寶科技公司），鼠Tregs、CD4＋CD62L＋初始T細胞磁珠分選試劑盒（美國Miltenyi Biontec公司），PCR試劑（TaKaRa公司），LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司），流式抗體（eBioscience公司），LightCycler定量PCR儀（Roche公司），FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司），Gel DocTMXR＋凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 實時熒光定量PCR法檢測細胞中miR-126的表達

MACS磁珠法分選BALB／c小鼠脾臟Tregs和CD4＋CD25－T（conventional T cell，Tcon）細胞，Trizol一步法提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA；用miR-126特異性發夾狀引物按試劑盒說明書操作應用LightCycler定量PCR儀對兩群細胞miR-126成熟體進行定量檢測，PCR反應條件按試劑盒說明書操作。在擴增結束后將擴增產物進行2%凝膠電泳分析，以確定擴增產物的特異性和靈敏度。miR-126成熟體目的基因相對表達水平＝特異基因的DNA含量／內參GAPDH的含量。

1.3 靶向miR-126 RNA反義寡核苷酸序列的設計和合成

通過miRBase數據庫查詢到miR-126（MIMAT0000137）序列為5′-CAUUAUUACUUUUGGUACGCG-3′，設計相應的反義寡核苷酸序列，正義鏈：CCGGCGCGTACCAAAAGTAATAATGTTTTTG；反義鏈：AATTCAAAAACATTATTACTTTTGGTACGCG；上下游序列分別含有AgeⅠ和Eco RⅠ酶切位點。將合成的正義鏈、反義鏈溶解于退火緩沖液中，90℃水浴15 min，自然冷卻進行退火反應形成雙鏈的DNA插入片段。

1.4 重組慢病毒載體的構建

將退火形成的雙鏈DNA插入片段和經AgeⅠ和Eco RⅠ酶切后線性化的pGCsil-LV-GFP質粒在T4DNA連接酶作用下于16℃連接過夜，轉化氯化鈣法新鮮制備的DH5α感受態細胞，菌液涂布在氨芐西林抗性的LB培養平皿，培養12 h，篩選陽性克隆并進行菌落PCR鑒定，將鑒定為陽性的克隆送美季生物公司測序分析；菌落PCR及測序引物由捷瑞生物公司合成，上游：5′-GGAAAGAATAGTAGACATAATAGC-3′；下游：5′-AATTCAAAAACATTATTACTTTTGGTACGCG-3′。將構建正確的質粒命名為pGCsil-miR-126-ASOs。

1.5 慢病毒顆粒的制備

調整293T細胞密度為1.2×107／mL，接種于20 cm培養皿，37℃，5%CO2全濕度培養24 h，待細胞匯合度達70%～80%時，將pGCsil-miR-126-ASOs、pHelper 1.0、pHelper 2.0 3種質粒利用LipofectamineTM2000共轉染293T細胞，8 h后更換為完全培養基，培養48 h后，收集上清液，于4℃，4000×g離心10 min，懸液用0.45μm濾器過濾，進行濃縮處理后于－80℃保存。

1.6 有限稀釋法測定病毒滴度

將100μL 293T細胞接種于96孔培養板，每孔4×104個，37℃、5%CO2全濕度培養36 h后進行病毒滴度測定。取8個無菌EP管，編為1～8號，每管中加90μL的Opti-MEM，1號管加10μL病毒顆粒，混勻后吸取10μL加入2號管混勻，依次倍比稀釋至8號管，選擇對應的培養孔，吸取90μL培養液，加入對應稀釋的病毒顆粒90μL，放入培養箱培養，24 h后，更換為100μL完全培養基，繼續培養72 h，倒置熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，根據表達GFP的293T細胞數目，計算病毒滴度。

1.7 感染CD4＋CD62L＋初始T細胞

MACS磁珠法分選CD4＋CD62L＋初始T細胞，用CD3e（2 mg／mL）抗體包被培養板，合并可溶性CD28抗體（2 mg／mL）、IL-2（100 U／mL）、TGF-β（10 ng／mL），在含10%胎牛血清、100 U／mL青霉素、100 mg／mL鏈霉素、1 mmol／L L-谷氨酰胺的RPMI 1640培養基中，誘導培養24 h，按MOI＝100加入相應體積的miR-126ASOs慢病毒顆粒，37℃、5%CO2全濕度培養12 h，更換為新鮮的培養基，繼續培養60 h，流式細胞術檢測Foxp3的表達，同時設立3個對照組：PBS組、pGCsil-對照組、TGF-β組。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 Tregs中miR-126的表達

實時PCR特異性探針法檢測Tregs和CD4＋CD25－T細胞中miR-126成熟體的表達水平，結果顯示miR-126在Tregs中的表達水平明顯高于CD4＋CD25－T細胞（t＝2.93，P＜0.01）。見圖1。

圖1 實時熒光定量PCR檢測Tregs和CD4＋CD25－T細胞m iR-126的表達Fig 1 Real-time PCR analysis of expression ofm iR-126 inTregs and CD4＋CD25－T cells

2.2 pGCsil-LV-GFP載體的線性化

對pGCsil-LV-GFP載體用限制性內切酶AgeⅠ和Eco RⅠ進行雙酶切，進行瓊脂糖凝膠電泳，酶切片段大小應為7 352 bp，結果顯示酶切片段大小正確（圖2）。

圖2 pGCsil-LV-GFP載體的線性化Fig 2 Enzyme cutting production of pGCsil-LV-GFP vector

2.3 重組質粒pGCsil-miR-126-ASOs的鑒定

線性化的pGCsil-LV-GFP載體和miR-126 ASOs插入片段的連接產物經轉化，挑選出陽性克隆，進行菌液PCR。瓊脂糖電泳結果顯示，8個克隆中只有2號克隆為陰性，其余克隆均為陽性，且產物大小正確（274 bp）（圖3）。篩選出的陽性克隆經搖菌、抽提質粒進行測序，與設計序列完全一致（圖4），結果表明成功構建pGCsil-miR-126-ASOs重組質粒。

圖3 陽性克隆PCR產物瓊脂糖凝膠電泳Fig 3 Agarose gel electrophoresis of the positive clone PCR product

圖4 重組質粒pGCsil-m iR-126-ASOs的DNA序列Fig 4 DNA sequencing analysis of the recombinant plasm id pGCsil-m iR126-ASOs

2.4 慢病毒顆粒的包裝及滴度

將pGCsil-miR-126-ASOs、pHelper 1.0和pHelper 2.0這3種質粒體外共轉染293T細胞，48 h后，逐步收集培養上清。濃縮慢病毒顆粒后，采用有限稀釋法感染293T細胞，倒置顯微鏡下觀察，可見GFP的表達（圖5），計數各培養孔表達GFP的陽性細胞數，計算得到病毒的滴度為9×108TU／mL。

圖5 pGCsil-m iR-126-ASOs慢病毒顆粒感染293T細胞后GFP的表達（×100）Fig 5 Expression of GFP in 293T cells infected by pGCsilm iR-126-ASOs lentivirus

2.5 miR-126 ASOs對Tregs的外周誘導的抑制

按文獻［9］報道建立Tregs的體外誘導體系，將表達pGCsil-miR-126-ASOs的慢病毒顆粒加入培養體系中，繼續培養72 h后，流式細胞術檢測Foxp3的表達。結果顯示PBS組、pGCsil-對照組、TGF-β組和pGCsil-miR-126-ASOs組中CD4＋T細胞的Foxp3表達比例分別為（0.93±2.02）%、（5.94± 0.02）%、（6.01±0.04）%、（1.55±0.02）%。分析發現，與TGF-β組比較，pGCsil對照對Tregs的外周誘導未產生明顯影響（t＝1.48，P＞0.05），而pGCsil-miR-126-ASOs Foxp3組的相對比率明顯降低（t＝97.5，P＜0.001），見圖6。

圖6 m iR-126-ASOs對Tregs外周誘導的影響Fig 6 Effects ofm iR-126-ASOs on the peripheral induction of Foxp3

3 討論

Tregs是能抑制免疫系統激活的獨特T細胞功能亞群，在維持機體的免疫自穩和自身耐受中具有重要的作用。目前認為Tregs主要包括從胸腺T細胞發育分化而來的nTreg和在特定的外周微環境中，由成熟CD4＋CD25－T細胞經誘導生成的iTreg［10］。大量研究顯示，iTreg在腫瘤免疫、黏膜免疫耐受和過敏性反應中均具有重要的作用［11］。因此，Tregs的外周誘導機制引起了研究者們的廣泛關注。已有的研究顯示，TGF-β-Smad信號途徑在Tregs的外周誘導中發揮了關鍵作用［12－13］。然而，在TGF-β誘導Foxp3表達過程中，如果PI3K-Akt信號途徑的磷酸化水平升高，則會抑制Foxp3的誘導表達，相反，提前抑制PI3K-Akt信號途徑的傳遞，則可上調Foxp3的表達［14－15］。由此可見，PI3K-Akt信號途徑在Tregs的外周誘導中也具有重要的調控作用。此外，還有研究顯示IL-2或CD28分子信號途徑也參與了Tregs的外周誘導過程［16－17］。然而，這些與Tregs外周誘導密切相關的關鍵信號途徑的調控分子至今仍未闡明。

近年來，越來越多的證據顯示多種miRNAs分子參與了Tregs的發育、分化和功能調節［6］。Cobb等［18］發現在Dicer－／－小鼠體內，Tregs的數量和功能明顯降低。Jiang等［19］的研究也發現miR-17和miR-19b通過作用于靶基因TGFβ-RⅡ、CREB1和PTEN調節Tregs的誘導分化過程。這些研究表明，特定的miRNAs在Tregs的外周誘導和功能發揮中起了關鍵的調控作用。然而，由于miRNAs分子家族成員的龐大和Tregs外周誘導機制的復雜性，只有深入研究特定miRNAs分子參與調控Tregs外周誘導的作用及機制才能為Tregs外周誘導機制的闡明提供幫助。

miR-126是新近報道的miRNAs家族成員，位于鼠的2號染色體EGFL7基因7號內含子［7］。大量研究顯示，miR-126在機體多種組織發育和臨床疾病如腫瘤發生中起了關鍵的調控作用。新近的研究［8］還發現系統性紅斑狼瘡患者CD4＋T細胞高表達miR-126，后者通過作用于靶分子Dnmt1調控CD4＋T細胞的功能。更重要的是，miR-126是PI3K-Akt信號途徑傳遞的重要調節分子［20］。鑒于PI3K-Akt的信號途徑在Tregs外周誘導中的重要性，我們首先通過實時熒光定量PCR法檢測Tregs中miR-126的表達水平。結果顯示，Tregs中miR-126的表達水平明顯高于CD4＋CD25－T細胞。多項研究表明，特定的miRNAs在T細胞的不同亞群中的差異表達對于T細胞的發育或功能具有重要意義。Zhou等［21］研究顯示miR-150在胸腺T細胞的CD4－CD8－雙陰性階段低表達，在CD4＋CD8＋雙陽性階段和CD8＋T細胞中適度表達，而在CD4＋T細胞中則高表達，提示miR-150的這種動態的變化可能對T細胞的發育具有調控作用。Curtale等［22］發現，miR-146a在初始T細胞中低表達，而在記憶性T細胞中高表達，進一步的研究發現初始T細胞在TCR信號刺激下，能誘導miR-146a的表達，期間需要NF-κB和c-ETS的結合位點參與。此外，該研究還發現miR-146a能影響除炎癥外的多種信號通路，能作為抗凋亡因子調控活化誘導的細胞死亡并作用于Fas相關死亡域蛋白，上調miR-146a的表達能削弱TCR刺激引起的AP-1（activator protein 1）和IL-2的產生。此外，微陣列技術分析表明，bic／miR-155缺失的小鼠CD4＋T細胞表現出Th2偏向的分化，進一步研究顯示小鼠的c-Maf和Itk表達升高，而c-Maf和Itk是Th2細胞分化的正向調節因子，這可能是miR-155缺失小鼠出現Th2分化偏向的原因之一［23］。因此，我們推測miR-126可能參與了Tregs外周誘導的調節過程。

作為抑制目的基因表達的手段之一，反義核酸技術也是研究miRNAs功能的有效工具，該技術是通過結合特異miRNAs，阻止其與靶基因的結合，抑制后者功能的發揮［24］。為進一步探討miR-126是否參與Tregs的外周誘導過程，我們通過分子克隆技術構建了基于慢病毒的miR-126 ASOs表達載體，測序結果表明載體構建成功。我們進一步將miR-126 ASOs表達載體和pHelper 1.0、pHelper 2.0共轉染293T細胞，將病毒收集濃縮后，通過有限稀釋法測定其滴度為9×108TU／mL。然后，我們將病毒加入Tregs的體外誘導體系中，結果顯示，當miR-126被特異性ASOs抑制后，Tregs的外周誘導比例明顯降低。我們推測該效應可能與miR-126被抑制后，增強了PI3K-Akt信號途徑的傳遞，從而削弱了Tregs的誘導。然而，其具體的分子機制仍待后續研究闡明。

總之，通過本實驗，我們發現Tregs高表達miR-126。更重要的是，通過構建的miR-126 ASOs慢病毒表達載體，我們發現，抑制miR-126可以有效地削弱Tregs的誘導，提示miR-126可能在Tregs外周誘導中發揮了重要作用。

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Construction of a lentiviral vectors of antisense oligonucleotide targeting on them iR-126 and its signficance

YANG Xue-yi1，2，LU Xiao-dong1，SHAO Qi-xiang1，LIU Jia-xiu2，LIU Juan3

（1.Department of School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Departmentof Laboratory＆Pharmacy，Huaiyin Advanced Vocational＆Technical School Of Health，Huai′an Jiangsu 223300；3.Departmentof Laboratory Medicine，the Forth People′s Hospital of Huai′an，Huai′an Jiangsu 223002，China）

Objective：To evaluate the expression of miR-126 in human peripheral blood CD4＋CD25＋regulatory T cells（Tregs），construct a lentiviral vector of antisense oligonucleotides（ASOs）againstmiR-126.M ethods：The expression level ofmiR-126 in Tregs and CD4＋CD25－T cellswas determined by real-time PCR respectively.The ASOs againstmiR-126 were synthesized and inserted into the pGCsil-LV-GFP plasmid and constructed the pGCsil-miR-126-ASOs plasmid which was indentified by RT-PCR and DNA sequencing.Additional，pHelper 1.0，pHelper 2.0 and pGCsil-miR-126-ASOs vectors were cotransfected into 293T cells by LipofectamineTM2000.After 48 h cultrue，the supernatantwas harvested and the titer of pGCsil-miR-126-ASOs lentivirus was determined by limiting dilution analysis.Finally，CD4＋CD62L＋na?ve T cellswere infected with pGCsil-miR-126-ASOs lentivirus at MOI（multiplicity of infection）＝100 and cultured in the presence of anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody plus IL-2 and TGF-βfor another 72 h，the expression of Foxp3 was analyzed by flow cytometry.Results：The expression level ofmiR-126 in Tregswas significantly higher than CD4＋CD25－T cells（P＜0.01）.Furthermore，themiR-126 ASOs inhibited the induction of Tregs in vitro（P＜0.05）.Conclusion：The lentiviral vector ofmiR-126 ASOswas constructed successfully and laid the foundation for the further re- search on themiR-126 ASOs in regulation of Treg functions.

miR-126；CD4＋CD25＋regulatory T cells；antisense oligonucleotides；lentiviral vector

R392.1

A

1671－7783（2014）01－0012－06

10.13312／j.issn.1671-7783.y130116

楊學藝（1980—），男，碩士研究生；邵啟祥（通訊作者），教授，博士研究生導師，E-mail：shao-qx＠mail.ujs.edu.cn

2013－05－31 ［編輯］陳海林