血管內皮祖細胞移植對大鼠重癥急性胰腺炎腎損傷的保護作用

黨勝春，王平江，曾艷華，陳榮芳，王豪，馮舒，崔磊，張建新

（江蘇大學附屬醫院普外科，江蘇鎮江212001）

血管內皮祖細胞移植對大鼠重癥急性胰腺炎腎損傷的保護作用

黨勝春，王平江，曾艷華，陳榮芳，王豪，馮舒，崔磊，張建新

（江蘇大學附屬醫院普外科，江蘇鎮江212001）

目的：探討內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）對大鼠重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）合并腎損傷的保護作用。方法：通過共沉淀法制備超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）；密度梯度離心法分離培養SD大鼠骨髓來源EPCs；使用SPIO標記EPCs；將72只SD大鼠隨機分為對照組、SAP組和SPIOEPCs組，采用胰腺被膜下均勻注射5%牛磺膽酸鈉制作SAP模型。對照組和SAP組經尾靜脈注射生理鹽水，SPIOEPCs組注射等量的SPIO-EPCs；分別于造模2，6，12 h檢測各組大鼠血清中淀粉酶、尿素氮、肌酐和腫瘤壞死因子 α（TNF-α）的水平；蘇木精染色觀察腎組織各時相病理變化及進行病理評分，普魯士藍染色觀察腎組織各時相鐵顆粒含量。結果：SAP組2，6，12 h的血清淀粉酶、尿素氮、肌酐和TNF-α的水平較對照組明顯升高（P＜0.01）；而SPIO-EPCs組均顯著低于SAP組（P＜0.01）。與對照組比較，SAP組2，6，12 h腎病理改變明顯加重，腎病理評分明顯提高（P＜0.05）；與SAP組比較，SPIO-EPCs組腎病理改變明顯減輕，腎病理評分明顯降低（P＜0.05）。普魯士藍染色見SPIOEPCs組在2，6和12 h腎組織血管內皮鐵顆粒含量逐漸增多。結論：移植EPCs可減少炎癥介質釋放，減輕SAP腎的血管內皮損傷，對大鼠SAP腎損傷具有保護作用。

內皮祖細胞；重癥急性胰腺炎；腎損傷；超順磁性氧化鐵；大鼠

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）常引起全身多器官障礙綜合征和全身炎癥反應綜合征，具有發病急、變化快、并發癥較多等特點。其中，急性腎損傷（acute renal injury，ARI）是SAP時常見并發癥，且病死率較高［1］。SAP時釋放的大量胰源性毒素、炎癥介質、多種細胞因子、血管活性物質及微循環改變引起的級聯反應是導致SAP相關性腎損傷的重要因素。

內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一類具有游走特性并能定向增殖分化為成熟血管內皮細胞的前體細胞，首次由Asahara等［2］在研究成體外周血時發現，并將細胞表面標志是CD133＋、CD34＋、VEGFR-2＋的細胞定義為EPCs。大量研究表明，通過移植EPCs或基因修飾的EPCs在治療缺血性心臟病、腦血管病及周圍血管病等方面具有重要的作用［3－5］。超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）可作為磁共振成像分子探針標記EPCs，進而檢測活體內細胞的遷徙、代謝和生物學行為，為以后移植EPCs治療器官損傷的磁共振成像示蹤奠定基礎。

本實驗通過移植SPIO標記的EPCs到SAP合并ARI大鼠模型中，目的在于探索EPCs能否更有效地保護SAP合并的腎損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

成年SD大鼠（江蘇大學實驗中心提供），淋巴細胞分離液（美國BD公司），CD34-FITC抗體、VEGFR-2-PE（美國Chemcon公司），EPCs培養基（齊氏生物科技有限公司），細胞消化酶液（齊氏生物科技有限公司），胎牛血清（美國HyClone公司），牛磺膽酸鈉（美國Sigma公司），六水合三氯化鐵（國藥集團化學試劑有限公司），七水合硫酸亞鐵（上海試劑二廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 SPIO制備 氧化鐵納米粒子的合成并與精氨酸（arginine）偶聯參考文獻［6－7］制備，采用共沉淀法制備Fe2O3水基磁流體（質量濃度為16 g／L），以精氨酸修飾，配成表面帶正電荷的納米 Fe2O3精氨酸水基磁性液體，質量濃度調整為2 g／L。1.2.2 大鼠骨髓EPCs的分離、培養及鑒定 大鼠骨髓EPCs的制備參照文獻［8］獲取。鑒定方法采用CD34、VEGFR-2表達的免疫熒光染色；EPCs培養2 d后，取部分EPCs，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗去固定液。分別加入15μL 0.2 mg／mL的抗鼠FITC-CD34和FITC-VEGFR-2，濕盒避光孵育2 h后，將PBS作為空白對照。PBS將多余抗體洗去，60%緩沖甘油封片后置于熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.2.3 SPIO標記EPCs 將SPIO加入第5代EPCs細胞培養液中進行標記，SPIO的終質量濃度為25 μg／mL，置培養箱內再孵育24 h，PBS洗滌3次以去除未進入細胞的鐵離子，37℃培養48 h后用0.25%胰蛋白酶消化細胞，制備成密度為4×109／L的細胞懸液并備用，測細胞標記率＞95%。

1.2.4 動物模型與分組及標記的EPCs移植 SD大鼠72只，體質量250～300 g，雌雄不限，實驗前12 h禁食不禁飲。SD大鼠隨機分為對照組、SAP組、SPIO-EPCs組。各組術后又分為2，6，12 h組，每組8只。按20 mg／kg體質量計算肌注氯胺酮進行麻醉，SAP組和SPIO-EPCs組麻醉后采用胰腺被膜下均勻注射5%牛磺膽酸鈉制作SAP模型［9］，對照組則用等量生理鹽水注射，關腹。

取備用的SPIO-EPCs懸液，無菌PBS稀釋懸液至2×109／L［10］。SPIO-EPCs組制模后尾靜脈緩慢注射0.4 mL SPIO-EPCs懸液，對照組和SAP組尾靜脈緩慢注射等量PBS。每組于2，6及12 h后分別抽取血樣及組織學觀察。

1.2.5 標本測定 每組分別于2，6及12 h各時相點取大鼠腸系膜上靜脈血液5 mL，3 000 r／min離心10 min，取上層血清－20℃保存。采用全自動生化分析儀測定血清淀粉酶、尿素氮、肌酐；采用酶聯免疫吸附反應（ELISA）方法檢測TNF-α，嚴格按照其試劑盒說明操作測定。

1.2.6 組織病理學檢查 分別于移植后2、6及12 h，取大鼠左腎（其中12 h后SAP組大鼠死亡2只，死亡率為25%），PBS清洗后，置于10%中性甲醛溶液中固定15～20 h，經過脫水、透明、浸蠟等過程制成蠟塊。蘇木精（HE）染色，光鏡下觀察腎組織病理變化；普魯士藍染色，光鏡下觀察各組腎組織鐵顆粒情況。腎組織損傷評分參照文獻［11］。每張切片隨機選取20個視野，對每個視野按標準進行單獨評分，20個視野的平均分數為動物的最后病理評分。

1.3 統計學處理

使用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析。計量指標以均數±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，方差不齊采用Kruskal-Wallis H檢驗，等級資料用非參數統計法的Man-Whitney檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Fe2O3-精氨酸粒子的制備

產物為近單個分散的球形納米顆粒，粒度均勻，未見明顯團聚，粒徑分布窄，約20 nm。

2.2 EPCs的形態學變化及免疫熒光鑒定

分離、培養大鼠骨髓來源的EPCs 2 d后，光鏡下觀察見細胞開始貼壁，呈長梭形、三角形、紡錘形或不規則形樣改變；免疫熒光染色可見經FITC標記的CD34，VEGFR-2染色的細胞表面呈綠色熒光，表達均為陽性。

2.3 移植EPCs預處理對SAP大鼠血清淀粉酶、尿素氮、肌酐和TNF-α的影響

SAP組2，6及12 h的淀粉酶、尿素氮、肌酐和TNF-α水平較對照組明顯升高（P＜0.01）；SPIOEPCs組血清淀粉酶、尿素氮、肌酐和TNF-α水平均顯著低于SAP組（P＜0.01），見圖1。

圖1 移植EPCs預處理對SAP大鼠血清淀粉酶、尿素氮、肌酐和TNF-α的影響

2.4 病理變化

2.4.1 腎組織學改變 大體觀察：對照組腎臟及腎臟周圍脂肪組織結構基本正常，SAP組2 h腎臟無明顯肉眼改變；6 h腎臟稍腫脹，被膜緊張，表面有散在出血點；12 h腎臟腫脹明顯，被膜高度緊張，腎臟表面有大量出血點。SPIO-EPCs組2 h腎臟病理改變不明顯，6 h及12 h腎病理變化較SAP組均明顯減輕。光鏡檢查：對照組2、6及12 h腎小球結構完整，未見異常；SAP組2 h腎小球結構變得稍模糊，間質結構界限欠清，間質細胞稍有變性；6 h腎小球結構破壞，間質內可見較多紅細胞；12 h腎小球萎縮，腎小球細胞形態破壞，間質內可見大量紅細胞；SPIO-EPCs組較SAP組均有明顯的改善。見圖2。

2.4.2 腎組織普魯士藍染色結果 SPIO-EPCs組在2，6及12 h腎組織血管內皮鐵顆粒含量逐漸增多，說明隨著時間的推移，SPIO標記的EPCs定向歸巢到受損傷的腎組織含量逐漸增多。見圖3。

圖2 光鏡下腎組織病理變化（HE×200）

圖3 腎組織普魯士藍染色（×200）

2.4.3 腎臟組織學評分 對照組腎組織結構正常；與對照組比較，SAP組腎病理改變明顯加重，腎病理評分顯著提高（P＜0.05）；與SAP組比較，SPIOEPCs組病理評分明顯降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 腎臟損傷評分

3 討論

SAP時大量的炎癥細胞被激活，同時伴隨大量的炎癥因子釋放，導致胰腺及胰外多器官的損傷。ARI是SAP常見并發癥之一，其主要的病理改變是腎小管的變性壞死。Mangione等［12］研究表明TNF-α是SAP發生發展中重要的細胞因子，能誘導IL-1和IL-6等產生，促進腎小球內皮細胞和上皮細胞合成內皮素-1，導致腎血管強烈收縮，加重腎缺血和血栓形成，并使炎性介質與氧自由基釋放增多，直接損傷腎組織。Zhang等［13］研究發現SAP時釋放的TNF-α通過Fas／Fasl系統將信號傳遞至Caspase家族導致細胞凋亡，同時能加強腎小球系膜細胞表達的細胞間黏附分子（ICMC-1）釋放，導致核轉錄因子（NF）-κB和活化蛋白（AP）-1結合從而引起腎細胞的凋亡。SAP合并ARI時由于炎性反應引起水電解質、酸堿平衡紊亂，腎小球濾過率降低及腎血流量減少，導致尿酸排出減少，加上腎小球內膜細胞下免疫復合物的形成，胰腺及其周圍炎性病變累及毗鄰的腎臟等，這些機制都在SAP引起ARI中發揮了重要的作用。

血管EPCs是血管內皮細胞的前體細胞，臍帶血、成體外周血及骨髓中均存在能分化為血管內皮細胞的EPCs。最近的研究表明EPC在內皮損傷或功能不全的修復中起重要作用［14］。從臍帶血或自身骨髓、外周血中分離EPCs，體外擴增后再向體內輸注，進行定向細胞治療，這可能成為SAP合并多器官損傷治療的理想方法。Rookmmaaker等［15］研究發現EPCs對腎小球內皮細胞的修復具有促進作用。Chade等［16］在研究豬腎動脈狹窄時，通過輸注自體EPCs，發現腎狹窄血管內皮生長因子表達增加，并伴有新血管生長成熟，進而減緩了腎微血管重構及動脈的纖維化。Patschan等［17］發現腎臟急性缺血時能夠快速動員EPCs到腎髓質乳頭部位，使其在腎臟內皮細胞中具有潛在修復作用。

SPIO在較弱的外磁場中產生巨大的磁性，而當磁場撤離后磁性也迅速消失，即所謂的超順磁性，該特性使其成為磁共振成像應用較廣的對比劑之一。利用干細胞吞噬SPIO來標記其本身，再通過體外細胞共培養，從而應用磁共振成像技術對細胞進行活體示蹤。但如何確定鐵濃度的安全有效范圍以有效標記EPCs，也是我們研究的重點。實驗表明，細胞內游離的鐵過多可使細胞的氧化作用加強，引起過多的氧化自由基釋放，損傷甚至破壞細胞［18］。Arbab等［19］研究表明，濃度為25μg／mL SPIO標記細胞不影響其生物活性，且能獲得較好的標記效果，但50μg／mL SPIO標記則影響其生物活性。

本實驗采用帶正電荷的精氨酸修飾納米化處理的氧化鐵顆粒，通過培養大鼠骨髓來源的EPCs，使帶負電荷的EPCs通過非特異性膜表面吸收攝取鐵顆粒進入細胞內，成功標記后，將EPCs移植到大鼠SAP合并ARI模型中。通過檢測大鼠血清中淀粉酶、尿素氮、肌酐和TNF-α的含量，同時觀察腎病理損傷的變化。結果表明，移植EPCs治療后，SPIOEPCs組血清淀粉酶、尿素氮、肌酐和TNF-α的含量均較SAP組顯著降低，腎病理損傷亦顯著降低。基于本實驗的結果，我們做出了如下推斷：SAP腎損傷炎癥反應釋放的炎癥介質以及多種未知因素能動員EPCs進入外周循環，進而遷移到受損部位，修復損傷的內皮組織，減少炎癥介質的釋放。但EPCs的動員、歸巢及修復血管內皮的具體機制目前尚不清楚，有待于進一步研究。

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Protecting effect of endothelial progenitor cell transplantation on renal injury w ith severe acute pancreatitis

DANG Sheng-chun，WANG Ping-jiang，ZENG Yan-hua，CHEN Rong-fang，WANG Hao，FENG Shu，CUILei，ZHANG Jian-xin
（Department of General Surgery，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To explore the protecting effect of endothelial progenitor cells（EPCs）transplantation on renal complicated injury with severe acute pancreatitis（SAP）.M ethods：Tomanufacture the superparamagnetic iron oxide（SPIO）by the coprecipitation method；collecting rat EPCs from bonemarrow，mononuclear cellswere isolated with ficoll，VEGF，fibroblast growth factor（FGF）in the culturemedium；EPCswere labeled by the SPIO；72 ratswere randomly divided into control group，SAP group，SPIO-EPCs group.The SAPmodels were established by injection of sodium taurocholate into the pancreatic capsule.Rats in the SPIO-EPCs group were injected with SPIO-EPCs through tail vein.Rats in SAP group and control group only

phosphate buffered solution with the same dose.Then the serum levels of AMS，BUN，Cr and TNF-αat2 h，6 h，12 h aftermodeling.Pathologic alteration of kidney were also observed.HE staining was used to observe the pathologic change of kidney tissue on different time between three groups.Prussian blue staining was used to observe the change of iron particles in SPIO-EPCs group on different time.Results：In SAP group serum levels of AMS，BUN，Cr and TNF-αwere significantly elevated compared with control group（P＜0.01）.Compared with SAP group，serum levels of AMS，BUN，Cr andTNF-αwere significantly decreased in SPIO-EPCs group（P＜0.01）.The pathological scores of renal in SAP group were higher than those of control group（P＜0.05）.The pathological scores of renal in SPIOEPCs group were lower than those of SAP group（P＜0.05）.From the Prussian blue staining，we can observe that the iron particles in renal vascular endothelial increased gradually on the time passed.Conclusion：EPCs transplantation can reduce the release of inflammatory mediators，reduce renal vascular endothelial injury SAP.The transplanting EPCs can alleviate the renal injury with SAP.

endothelial progenitor cells；severe acute pancreatitis；renal injury；superparamagnetic iron oxide；rat

R576

A

1671－7783（2014）01－0001－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y130253

國家自然科學基金資助項目（81070287）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK2011484，BK2012704）

黨勝春（1972—），男，江蘇泗陽人，副教授，副主任醫師，博士，主要從事胰腺炎基礎和臨床研究。

2013－11－12 ［編輯］何承志