神經退行性疾病治療中靶蛋白GPR 17與其激動劑和拮抗劑相互作用的分子模擬

葉 桓 劉 述

神經退行性疾病治療中靶蛋白GPR 17與其激動劑和拮抗劑相互作用的分子模擬

葉 桓 劉 述

目的 尋找高選擇性的GPR 17受體的拮抗劑對于神經退行性疾病的治療具有重要意義。方法 本研究經過對GPR 17三維結構的長時程分子動力學模擬后，利用AutoDock軟件將GPR 17的激動劑UDP（二磷酸尿苷），拮抗劑MRS 2179對接進活性口袋中，并分析其結合模式。結果 GPR 17的核苷酸結合口袋相似于其他P 2Y受體，拮抗劑UDP，MRS 2179能特異地與GPR 17結合，形成穩定的復合物構象，其中Arg 255在配體識別過程中起到關鍵作用。結論 本研究為設計新型的GPR 17受體拮抗劑提供了理論指導。

神經退行性疾病；GPR 17；分子對接；分子動力學

神經退行性疾病如老年性癡呆（AD）的病理特征為Aβ多肽沉積在神經元周圍，神經元內Tao蛋白異常磷酸化，小膠質細胞被激活，產生慢性炎癥，導致腦內大量神經元壞死，促進神經再生可能是治療老年性癡呆等神經退行性疾病的有效途徑[1-4]。

目前，關于GPR 17受體的中樞作用研究表明，GRP 17受體是腦和脊髓損傷的感受器，損傷后GPR 17表達會升高，拮抗GPR 17表達能減輕腦缺血損傷和脊髓損傷，發揮神經保護作用[5-6]。目前，還沒有GPR 17的特異性拮抗劑，開發GPR 17的拮抗劑可能是治療神經退行性疾病的一條新的有效途徑。分子進化研究表明，GPR 17位于系統發育的兩大受體家族，P 2Y核苷酸受體和半胱氨酰白三烯(Cys-LT)受體家族的中間位置，可以被內源性配體半胱氨酰白三稀及細胞外核苷酸所激活，引起腺甘酸環化酶抑制和細胞內鈣離子釋放增加。細胞外核苷酸是與種系發育相關的重要的細胞外信號分子，這類物質失調與炎癥性疾病包括腦缺血密切相關，細胞外核苷酸包括腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP)、尿嘧啶核苷酸(UTP、UDP)以及糖基化核苷酸(UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖)等。

GRP 17作為一種G蛋白偶聯受體，具有七螺旋跨細胞膜結構（TM）（如圖1），然而，GRP 17的晶體結構尚未被解析，本研究只能采用同源建模的方法獲得GPR 17的三維結構，通過長時程的分子動力學模擬后，將小分子二磷酸尿苷(Uridine diphosphate，UDP)激動劑和MRS 2179拮抗劑對接進GRP 17受體的結合口袋中，討論細胞外信號分子激活G蛋白偶聯受體的分子機理，為開發治療老年性癡呆等神經退行性疾病的新藥提供指導。

圖1 GPR 17的蛋白分子結構

1 材料與方法

1.1 小分子配體文件的準備 在Chemdraw 軟件中畫出UDP和MRS 2179的結構圖，并以MDL Molfile(*.mol)格式存儲（見圖1）；使用OpenBabel 軟件導入已經建立的格式文件，使用其convert功能，將小分子轉換成為SYBYL Molfile(*.mol 2)的三維結構格式文件。量子化學軟件MOPAC在AM 1水平上對小分子的構象進行能量優化，而且加上原子凈電荷（partial charge）。

1.2 大分子受體蛋白的分子動力學模擬 GPR 17的UNIPROT編號為Q 13304，共有367個氨基酸。登陸GPCRRD數據庫（http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ GPCRRD/），下載采用GPCR-I-TASSER算法構建的GPR 17的三維模擬結構(具體流程如圖3)。研究人員通過此算法已經構建了1028個人類GPCR的三維結構。然而采用GPR 17的人工三維模擬結構還不能直接用于分子對接。為了模擬真實情況，在進行分子對接之前，本研究采用由美國伊利諾斯大學開發的分子動力學模擬程序包NAMD 2.9（http://www.ks.uiuc.edu/ Research/namd/），將GPR 17插入磷脂雙層膜（DPPC膜，二棕櫚酸磷脂酰膽堿）中，進行長時程的分子動力學模擬。模擬體系用VMD 軟件（http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/）構建，在膜蛋白體系的上下層中加入水分子（2 nm厚），水分子采用TIP 3P模型；為了保證體系的電中性，加入濃度為0.15 M的KCL溶液（生理離子濃度）來中和體系，整個體系有367個氨基酸，133個磷脂分子，3047個水分子，27個陽性鉀離子，45個陰性氯離子，共有60301個原子。模擬過程中溫度保持在300 K，同時保持1個大氣壓的恒壓。為使該體系達到平衡，首先固定磷脂頭部和蛋白質，用最陡下降法進行 1000 步的能量優化來優化磷脂尾部和水分子，然后固定磷脂尾部和蛋白質對磷脂頭部和水分子繼續進行1000步能量優化。體系平衡后進行5 ns分子動力學模擬，采用的是CHARMM 36力場[7]。

圖2 UDP和MRS 2179的化學結構式

圖3 GPCR-I-TASSER算法流程圖

1.3 分子對接 GPR 17受體經過5 ns分子動力學模擬后，挑選一個合適的蛋白構象用于分子對接，采用國際上廣泛使用的免費分子對接軟件AutoDock 4.0（http://autodock. scripps.edu/），對接前，將GPR 17蛋白加極性氫，加Kollman United點電荷，保存為macro.pdbq文件。利用Autogrids程序設定格點（grid），為了探索GPR 17的活性口袋，我們將將格點平均數設為150×150×150，格點空間距離為0.375，用mkgpf 3程序生成.gpf文件。將小分子UDP和MRS 2179的原子類型匯總，輸入的參數準備gpf文件和dpf文件，在dpf文件中，“ga_num_evals”和“ga_num_evaluations”用于限定程序收斂條件，決定運算費時長短。將ga_num_evals=10000000；ga_ run=100（默認10）；ga_pop_size=300（默認150）；其余參數采用AutoDock 4.0的默認值。對接后，將受體-配體復合物再進行5 ns的分子動力學模擬，具體參數同上。

分子動力學模擬計算在Linux集群系統上應用GPU/ CUDA技術完成。

2 結果

GPR 17受體的動力學優化在模擬的磷脂雙層膜中進行（如圖4）。分子動力學結果表明，優化體系達到平衡后，進行5 ns的分子動力學模擬，根據對均根方差（RMSD）的觀察，可以看出該蛋白結構已經達到穩定。分子對接后，再進行5 ns的分子動力學模擬，蛋白復合物也達到穩定（如圖5）。

圖4 GPR 17受體的分子動力學模擬體系。

GPR 17位于P 2Y核苷酸受體和半胱氨酰白三烯受體家族的中間位置，通過研究P 2Y受體的結合位點可以為研究GPR 17與配體結合提供依據。研究表明，GPR 17的核苷酸結合區與P 2Y受體的核苷酸結合區位置相同，核苷酸結合口袋位于TM 3，TM 5，TM 6 and EL 2之間[8-9]。根據以往研究，對于所有的P 2Y-核苷酸受體配體復合物，核苷酸配體的磷酸鹽部分容納在由三個氨基酸3.29（第3個跨膜螺旋第29個氨基酸，余以此類推），7.39 和6.55組成的陽性離子口袋中，GPR 17的氨基酸Arg 283對應于氨基酸 6.55，Gly 136對應于氨基酸3.29，Ser 311對應于氨基酸7.39，雖然Gly 136不能顯示支鏈的相互作用，但能提高支鏈的柔性。通過研究多個P 2Y 受體的EL 2（細胞膜外第2個loop，余以此類推），在GPR 17受體EL 2上存在一個重要的酸性氨基酸Glu 202，位于兩個保守的半胱氨酸之前，對于穩定受體配體復合物起到重要作用。

圖5 GPR 17受體分子動力學模擬體系的RMSD

圖6 分子對接結果

通過誘變研究P 2Y 1受體，氨基酸3.29和Asp 232 (EL 2)參與了由配體引起的受體激活，同時氨基酸3.29參與了與Glu 207(EL 2)的離子相互作用，這對于保持受體的基礎狀態非常重要。核苷酸的磷酸部分與Arg 131的支鏈相互作用，可以使Arg 131-Glu 207離子對去穩定化，參與了受體激活。在GPR 17 TM 3上的氨基酸Arg 133，靠近氨基酸3.29，作為一個保守的陽離子氨基酸，Arg 133與Tyr 41，Tyr 200和Ser 224的支鏈形成一個穩定的相互作用。在GPR 17，靠近氨基酸3.29的負離子氨基酸是Gln 211，能與Tyr 144 S，Ser 224和His 220形成穩定的氫鍵。

分析分子對接的結果，小分子二磷酸尿苷(UDP)是GPR 17的天然配體之一，可作為激動劑激活GPR 17受體，UDP與GPR 17的結合模式在圖6顯示，GPR 17的核苷酸結合位點與UDP的二磷酸鹽存在多個相互作用，使二磷酸鹽在活性口袋內穩定；Arg 283(6.55)的胍基部分和α和β-磷酸形成離子鍵；β-磷酸和Tyr 213(EL 2)，Tyr 140(TM 3)和Tyr 290(EL 3)的羥基形成一個氫鍵網絡，并與His 280 (TM 6)的支鏈相互作用；Gln 211(EL 2)與α-磷酸和β-磷酸結合；EL 2上的Gln 199，其支鏈指向細胞膜內，在活性口袋內接近UDP的磷酸部分，同時，His 220(TM 5)，Tyr 144(TM 3)，Ser 224(TM 5)和Tyr 279(TM 6)的支鏈也位于口袋內。UDP的鳥苷環部分，主要與TM 1和TM 7的氨基酸存在極性相互作用，尿嘧啶的4-O部分與Ser 311(TM 7)和Tyr 66 (TM 1)的羥基部分作用，而3-NH部分與Ser 315(TM 7)作用；UDP的鳥苷環部分在活性口袋中存在大量疏水相互作用，包括與Tyr 179，Phe 139，Phe 276和Tyr 140；Asn 204（EL 2）和Ser 311(7.43)存在一個氫鍵，結構保守的氨基酸Ser 311(7.43)，Tyr 66(1.39)和Phe 139(3.32)可以通過靜電相互作用固定尿嘧啶堿基，此外，保守的Arg 283(6.55)也參與結合UTP的尿嘧啶堿基。UDP的糖基部分與GPR 17的7 TM區域存在特殊聯系，核糖的2'-OH部分與Asn 142(3.55)和Thr 314(7.42)形成氫鍵，3'-OH指向TM 6，但是沒有直接參與任何特殊的氫鍵。

本研究還模擬了一個選擇性P 2Y受體拮抗劑MRS 2179與GPR 17的相互作用，MRS 2179作為核糖核苷酸類似物，結合在GPR 17受體同樣的口袋中，如圖5，MRS 2179的磷酸部分與Arg 255殘基存在有靜電相互作用，而且，3'和5'磷酸鏈通過氫鍵穩定在口袋中。3'-磷酸部分形成氫鍵通過His 280(TM 6)的支鏈(N 1)；Tyr 144(TM 3)的羥基部分與3'-磷酸部分的氧原子相互作用。Gln 211(EL 2)的NH 2部分與MRS 2179的3'-磷酸部分形成氫鍵。The 5'-磷酸部分與Tyr 213(EL 2)，Thr 203(EL 2) and Tyr 279 (TM 6)的羥基部分形成氫鍵。

MRS 2179的腺嘌呤部分，N 7與Arg 115(TM 2)相互作用，N 6與Ser 7.43(TM 7)相互作用，N 1與Asn 142(TM 3)相互作用，N 3與Phe 139的骨架相互作用。在活性口袋中，Phe 139和Phe 276殘基的疏水部分容納核苷。

對于UDP和MRS 2179，一個主要的相互作用參與磷酸部分 (尤其是α-磷酸)與堿性Arg 283殘基。總之，受體的主要功能區結合UDP，MRS 2179重疊。尿苷的原子1與腺嘌呤的N 9重疊，MRS 2179的3'-磷酸部分與UDP的α-磷酸部分重疊，然而核糖占據相同空間區域在螺旋束中間。

總之，對于UDP，尿嘧啶環與TM 7，TM 3和TM 1結合，指向TM 1和TM 2，雙磷酸部分與TM 3和TM 6結合，并指向TM 5，TM 6和EL 2。對于MRS 2179，腺嘌呤環結合TM 7和TM 3并指向TM 1和TM 2，磷酸部分結合在TM 3、TM 7、TM 6和EL 2，5'-磷酸指向EL 2，3'-磷酸指向TM 5和TM 6。

3 討論

在大鼠局灶性缺血模型，體內敲除GPR 17基因或者注射P 2Y/CysLT拮抗劑可以減少缺血損傷的進程，揭示GPR 17是一個新型的神經治療靶點。研究GPR 17的結構和配體結合機制對于研發選擇性和潛在的藥物是非常必要的。

目前大多數研究GPR 17是通過基因干擾等手段，然而對其結構的構建與分析必須借助計算機模擬的方法，研究表明，在1321 N 1細胞，異源性表達GPR 17，阻滯白三烯結合位點采用CysLT 拮抗劑并不能取消尿嘧啶的反應，然而，阻滯核苷酸位點可以允許白三烯LTD 4起反應[10-11]，這些現象僅通過生物實驗是無法揭示其機制的。

本研究采用計算機分子模擬的方法，采用同源模建的方法構建的GPR 17三維結構，將其置于磷脂雙膜中進行長時程的分子動力學模擬，然后將激動劑以及拮抗劑分別對接進GPR 17的活性口袋中。計算機模擬的方法可以將分子的微觀世界形象表達出來，不僅直觀準確，而且節約了人力物力，特別是對于一些實驗室無法開展的生物實驗更具優勢。

GPR 17作為一個新型的“雙雜交受體”，我們的計算機模擬研究幫助設計雙靶向配體治療神經退行性病變，隨著技術不斷進步，對中樞神經系統內GPR 17分子特性以及作用的深入研究，必將推進中樞神經系統疾病的研究進展，并且也為尋找防治手段開辟新的途徑。

[1] Harvey K，Marchetti B.Regulating Wnt signaling:a strategy to prevent neurodegeneration and induce regeneration[J].J Mol Cell Biol,2014,6(1):1-2.

[2] Varnum MM,Ikezu T.The classification of microglial activation phenotypes on neurodegeneration and regeneration in Alzheimer's disease brain[J].Arch Immunol Ther Exp (Warsz),2012,60(4):251-266.

[3] Rambukkana A.Usage of signaling in neurodegeneration and regeneration of peripheral nerves by leprosy bacteria[J].Prog Neurobiol,2010,91(2):102-107.

[4] Salmina AB Inzhutova AL,Malinovskaya NA,et al.Endothelial dysfunction and repair in Alzheimer-type neurodegeneration:neuronal and glial control[J].J Alzheimers Dis,2010,22(1):17-36.

[5] Ceruti S.The P2Y-like receptor GPR17 as a sensor of damage and a new potential target in spinal cord injury[J].Brain,2009,132(Pt 8):2206-2218.

[6] Lecca D.The recently identified P 2Y-like receptor GPR 17 is a sensor of brain damage and a new target for brain repair[J].PLoS One,2008,3(10):e 3579.

[7] Huang J，MacKerell AD Jr.CHARMM 36 all-atom additive protein force field:validation based on comparison to NMR data[J].J Comput Chem,2013,34(25):2135-2145.

[8] Abbracchio MP.Characterization of the UDP-glucose receptor (re-named here the P 2Y 14 receptor) adds diversity to the P 2Y receptor family[J]. Trends Pharmacol Sci,2003,24(2):52-55.

[9] Schulz A,Schoneberg T.The structural evolution of a P 2Y-like G-protein-coupled receptor[J].J Biol Chem,2003,278(37):35531-35541.

[10] Pugliese AM.Functional characterization of two isoforms of the P 2Y-like receptor GPR 17:[35 S]GTPgammaS binding and electrophysiological studies in 1321 N 1 cells[J].Am J Physiol Cell Physiol,2009,297(4):C 1028-1040.

[11] Qi AD，Harden TK，Nicholas RA,Is GPR 17a P 2Y/leukotriene receptor? examination of uracil nucleotides，nucleotide sugars，and cysteinyl leukotrienes as agonists of GPR 17[J].J Pharmacol Exp Ther,2013,347(1):38-46.

Objective Looking for a high selectivity GPR 17 receptor antagonists for the treatment of neurodegenerative diseases is of great significance. Methods This study on GPR 17 three-dimensional structure after long time history of the molecular dynamics simulation, Use AutoDock software will GPR 17 agonist UDP (ii) uridine phosphate, antagonists MRS 2179 butt into active pocket, and analyzes the combination model. Results GPR 17 nucleotides in combination with pockets, similar to other P 2Y receptors antagonists UDP, MRS 2179 can combine with GPR 17, specific form stable complex conformation, including Arg 255 played a key role in the process of ligand recognition. Conclusion This study for the design of new GPR 17 receptor antagonists provides theoretical guidance.

Neurodegenerative diseases; GPR 17; Molecular docking; Molecular dynamics

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.33.001

廣東省自然科學基金 (S 2012010009215）

安徽 510080 安徽省兒童醫院神經外科 （葉桓） 230032 安徽醫科大學人體解剖學教研室；廣東 510080 中山大學中山醫學院人體解剖學教研室（劉述）

劉述 E-mail：mrliushu@126.com