禽傳染性支氣管炎病毒一步法RT—PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

潘志剛+李軍港

摘要：為建立一種快速檢測禽傳染性支氣管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）病原的方法，根據(jù)GenBank上的禽傳染性支氣管炎病毒基因組序列，設(shè)計1對引物，建立了檢測IBV的一步法RT PCR方法，該方法對20份疑似傳染性支氣管炎（Infectiousbronchitis，IB）病料、傳染性法氏囊病毒（Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV）、新城疫病毒（Newcastaldiseasevirus，NDV）進(jìn)行檢測，結(jié)果僅IBV為陽性，IBDV、NDV均為陰性。該一步法RT PCR方法具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性，最低可檢測出約4pg的IBVRNA，將為IBV的病原檢測及分子流行病學(xué)調(diào)查等提供早期快速的診斷方法。

關(guān)鍵詞：禽傳染性支氣管炎病毒；RT PCR；檢測

中圖分類號：S831文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-273X（2014）03-0016-02

雞傳染性支氣管炎（Infectiousbronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞的呼吸、泌尿生殖和消化等系統(tǒng)[1]，常給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。IBV是單股正鏈RNA病毒，一般對病毒的擴(kuò)增都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，本試驗將RT PCR反應(yīng)中反轉(zhuǎn)錄和PCR兩個反應(yīng)所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一個反應(yīng)管中，同一反應(yīng)體系中一步完成從反轉(zhuǎn)錄到PCR的全部反應(yīng)，且擴(kuò)增產(chǎn)物可直接點樣電泳，此一步法操作簡便，降低操作過程中的污染幾率，目前已成為臨床上檢測和疾病診斷的一個重要發(fā)展方向[2]。

1材料與方法

1.1病毒

IBV、IBDV和NDV均由萊山區(qū)某公司生物工程中心保存；20份疑似IB病料采自萊山區(qū)某養(yǎng)殖場。

1.2主要試劑

EasyPureViralDNA/RNAKit和一步法RT PCR檢測試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上的禽傳染性支氣管炎病毒基因組序列設(shè)計引物。

F：5`-GGTATAGTGTGGGTTGCTG-3`，R：3`-CCTTAATACCTTCCTCATTC-5`，擴(kuò)增片段大小為459bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4病毒的增殖

經(jīng)尿囊腔接種0.2mL10倍稀釋的IBV，37℃培養(yǎng)，棄去24h內(nèi)死亡的，72h后收取尿囊液。

1.5病毒

RNA的提取參照EasyPureViralDNA/RNAKit說明書進(jìn)行。

1.6一步法

RT PCR的建立采取20 L的反應(yīng)體系，按照試劑盒介紹的方法進(jìn)行。在反應(yīng)體系中分別加入RNA Template1 L，F(xiàn)orwardGSP（10 M）0.4 L，ReverseGSP（10 M）0.4 L，2*One StepReactionMix10 L，TransScriptTMOne StepEnzymeMix0.4 L，RNase freeWater加至總體積20 L，采取的擴(kuò)增程序為94℃5min；94℃30S，55℃30s，72℃min30個循環(huán)；72℃10min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7特異性試驗

用建立的一步法RT PCR分別檢測IBV、IBDV和NDV，驗證該方法檢測IBV的特異性。

1.8敏感性驗證

將已定量的IBV毒株提取的RNA進(jìn)行10倍倍比稀釋，稀釋度分別為10 1～10 5，用建立的一步法RT PCR進(jìn)行檢測，驗證該方法的敏感性。

1.9田間試驗

采用建立的一步法RT PCR檢測方法，對大規(guī)模養(yǎng)殖場2013年采集的3批60份樣品進(jìn)行IBV監(jiān)測，疑似陽性則用雞胚分離鑒定，然后用IBV抗血清進(jìn)行中和試驗和瓊脂擴(kuò)散試驗以鑒定病毒。

2 結(jié)果與分析 2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，在459bp處可見特異性片段，大小與預(yù)期相符，見圖1。

2.2特異性的試驗結(jié)果用建立的一步法

RT PCR同時檢測IBV、IBDV和NDV，僅IBV可擴(kuò)增出約500bp的目的基因條帶，而IBDV和NDV及陰性對照均未擴(kuò)增出目的片段，見圖2。表明該方法特異性較好。

2.IBDV；3.NDV；4.為陰性對照

2.3 敏感性的試驗結(jié)果用建立的一步法

RT PCR最低可檢出稀釋度為10 4的病毒RNA，即約4 pg的IBV RNA，見圖3。

2.4田間試驗結(jié)果

2013年采集大規(guī)模養(yǎng)殖場采集的3批60份樣品進(jìn)行IBV監(jiān)測，采用所建立的一步法RT PCR檢測方法，篩選檢測陽性共5份，陽性率為8.33%。樣品經(jīng)雞胚分離鑒定，然后用IBV抗血清進(jìn)行中和試驗和ELISA試驗，結(jié)果完全符合。

3討論

近年來，傳染性支氣管炎病的流行出現(xiàn)了新的特點，其剖檢癥狀不典型，給臨床診斷帶來很大的困擾，而目前檢測IBV的常用實驗室方法有病毒分離[3]、瓊脂擴(kuò)散試驗[3]、ELISA[4]、RT PCR[5]，這些方法各有優(yōu)缺點：病原的分離鑒定是臨床上診斷IBV的重要方法，但是該方法操作繁瑣，檢測周期長[6]；瓊脂擴(kuò)撒試驗操作簡單，但敏感性不高，該方法一般多用于檢測IBV抗原，不推薦檢測IBV抗體[7]；ELISA檢測IBV的優(yōu)點比一般的血清學(xué)試驗均敏感，但此法的缺點不能區(qū)分抗體是何種毒株刺激機體產(chǎn)生的[1]；RT PCR技術(shù)具有靈敏、快速、特異性強、操作簡單等特點。

兩步法RT PCR反應(yīng)一般在PCR儀上先花費1.5h的反轉(zhuǎn)錄時間，再停機加入PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行下一步的PCR反應(yīng)，操作繁瑣，而且花費很多試劑準(zhǔn)備試劑、加樣。而一步法RT PCR技術(shù)只需將反應(yīng)中反轉(zhuǎn)錄和PCR兩個反應(yīng)所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一個反應(yīng)管中，同一反應(yīng)體系中一步完成從反轉(zhuǎn)錄到PCR的全部反應(yīng)，且擴(kuò)增產(chǎn)物可直接點樣電泳，此一步法操作簡便易行，而且最大限度地降低了外來因素的污染，更適合廣大基層大量樣品的快速檢測。

本研究根據(jù)IBV保守區(qū)序列設(shè)計1對引物，建立了檢測IBV的一步法RT PCR檢測方法，結(jié)果顯示該方法特異性好，靈敏度較高，為今后IB的快速診斷和病原學(xué)的研究提供了有力的工具。

參考文獻(xiàn)：

[1]BW卡爾尼克.禽病學(xué)[M].高 福，蘇敬良，譯.第10版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1999.

[2]廖 敏，謝芝勛，謝志勤，等.一步法RT PCR檢測禽呼腸孤病毒的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2003，25（1）：53 55.

摘要：為建立一種快速檢測禽傳染性支氣管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）病原的方法，根據(jù)GenBank上的禽傳染性支氣管炎病毒基因組序列，設(shè)計1對引物，建立了檢測IBV的一步法RT PCR方法，該方法對20份疑似傳染性支氣管炎（Infectiousbronchitis，IB）病料、傳染性法氏囊病毒（Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV）、新城疫病毒（Newcastaldiseasevirus，NDV）進(jìn)行檢測，結(jié)果僅IBV為陽性，IBDV、NDV均為陰性。該一步法RT PCR方法具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性，最低可檢測出約4pg的IBVRNA，將為IBV的病原檢測及分子流行病學(xué)調(diào)查等提供早期快速的診斷方法。

關(guān)鍵詞：禽傳染性支氣管炎病毒；RT PCR；檢測

中圖分類號：S831文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-273X（2014）03-0016-02

雞傳染性支氣管炎（Infectiousbronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞的呼吸、泌尿生殖和消化等系統(tǒng)[1]，常給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。IBV是單股正鏈RNA病毒，一般對病毒的擴(kuò)增都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，本試驗將RT PCR反應(yīng)中反轉(zhuǎn)錄和PCR兩個反應(yīng)所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一個反應(yīng)管中，同一反應(yīng)體系中一步完成從反轉(zhuǎn)錄到PCR的全部反應(yīng)，且擴(kuò)增產(chǎn)物可直接點樣電泳，此一步法操作簡便，降低操作過程中的污染幾率，目前已成為臨床上檢測和疾病診斷的一個重要發(fā)展方向[2]。

1材料與方法

1.1病毒

IBV、IBDV和NDV均由萊山區(qū)某公司生物工程中心保存；20份疑似IB病料采自萊山區(qū)某養(yǎng)殖場。

1.2主要試劑

EasyPureViralDNA/RNAKit和一步法RT PCR檢測試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上的禽傳染性支氣管炎病毒基因組序列設(shè)計引物。

F：5`-GGTATAGTGTGGGTTGCTG-3`，R：3`-CCTTAATACCTTCCTCATTC-5`，擴(kuò)增片段大小為459bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4病毒的增殖

經(jīng)尿囊腔接種0.2mL10倍稀釋的IBV，37℃培養(yǎng)，棄去24h內(nèi)死亡的，72h后收取尿囊液。

1.5病毒

RNA的提取參照EasyPureViralDNA/RNAKit說明書進(jìn)行。

1.6一步法

RT PCR的建立采取20 L的反應(yīng)體系，按照試劑盒介紹的方法進(jìn)行。在反應(yīng)體系中分別加入RNA Template1 L，F(xiàn)orwardGSP（10 M）0.4 L，ReverseGSP（10 M）0.4 L，2*One StepReactionMix10 L，TransScriptTMOne StepEnzymeMix0.4 L，RNase freeWater加至總體積20 L，采取的擴(kuò)增程序為94℃5min；94℃30S，55℃30s，72℃min30個循環(huán)；72℃10min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7特異性試驗

用建立的一步法RT PCR分別檢測IBV、IBDV和NDV，驗證該方法檢測IBV的特異性。

1.8敏感性驗證

將已定量的IBV毒株提取的RNA進(jìn)行10倍倍比稀釋，稀釋度分別為10 1～10 5，用建立的一步法RT PCR進(jìn)行檢測，驗證該方法的敏感性。

1.9田間試驗

采用建立的一步法RT PCR檢測方法，對大規(guī)模養(yǎng)殖場2013年采集的3批60份樣品進(jìn)行IBV監(jiān)測，疑似陽性則用雞胚分離鑒定，然后用IBV抗血清進(jìn)行中和試驗和瓊脂擴(kuò)散試驗以鑒定病毒。

2 結(jié)果與分析 2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，在459bp處可見特異性片段，大小與預(yù)期相符，見圖1。

2.2特異性的試驗結(jié)果用建立的一步法

RT PCR同時檢測IBV、IBDV和NDV，僅IBV可擴(kuò)增出約500bp的目的基因條帶，而IBDV和NDV及陰性對照均未擴(kuò)增出目的片段，見圖2。表明該方法特異性較好。

2.IBDV；3.NDV；4.為陰性對照

2.3 敏感性的試驗結(jié)果用建立的一步法

RT PCR最低可檢出稀釋度為10 4的病毒RNA，即約4 pg的IBV RNA，見圖3。

2.4田間試驗結(jié)果

2013年采集大規(guī)模養(yǎng)殖場采集的3批60份樣品進(jìn)行IBV監(jiān)測，采用所建立的一步法RT PCR檢測方法，篩選檢測陽性共5份，陽性率為8.33%。樣品經(jīng)雞胚分離鑒定，然后用IBV抗血清進(jìn)行中和試驗和ELISA試驗，結(jié)果完全符合。

3討論

近年來，傳染性支氣管炎病的流行出現(xiàn)了新的特點，其剖檢癥狀不典型，給臨床診斷帶來很大的困擾，而目前檢測IBV的常用實驗室方法有病毒分離[3]、瓊脂擴(kuò)散試驗[3]、ELISA[4]、RT PCR[5]，這些方法各有優(yōu)缺點：病原的分離鑒定是臨床上診斷IBV的重要方法，但是該方法操作繁瑣，檢測周期長[6]；瓊脂擴(kuò)撒試驗操作簡單，但敏感性不高，該方法一般多用于檢測IBV抗原，不推薦檢測IBV抗體[7]；ELISA檢測IBV的優(yōu)點比一般的血清學(xué)試驗均敏感，但此法的缺點不能區(qū)分抗體是何種毒株刺激機體產(chǎn)生的[1]；RT PCR技術(shù)具有靈敏、快速、特異性強、操作簡單等特點。

兩步法RT PCR反應(yīng)一般在PCR儀上先花費1.5h的反轉(zhuǎn)錄時間，再停機加入PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行下一步的PCR反應(yīng)，操作繁瑣，而且花費很多試劑準(zhǔn)備試劑、加樣。而一步法RT PCR技術(shù)只需將反應(yīng)中反轉(zhuǎn)錄和PCR兩個反應(yīng)所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一個反應(yīng)管中，同一反應(yīng)體系中一步完成從反轉(zhuǎn)錄到PCR的全部反應(yīng)，且擴(kuò)增產(chǎn)物可直接點樣電泳，此一步法操作簡便易行，而且最大限度地降低了外來因素的污染，更適合廣大基層大量樣品的快速檢測。

本研究根據(jù)IBV保守區(qū)序列設(shè)計1對引物，建立了檢測IBV的一步法RT PCR檢測方法，結(jié)果顯示該方法特異性好，靈敏度較高，為今后IB的快速診斷和病原學(xué)的研究提供了有力的工具。

參考文獻(xiàn)：

[1]BW卡爾尼克.禽病學(xué)[M].高 福，蘇敬良，譯.第10版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1999.

[2]廖 敏，謝芝勛，謝志勤，等.一步法RT PCR檢測禽呼腸孤病毒的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2003，25（1）：53 55.

摘要：為建立一種快速檢測禽傳染性支氣管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）病原的方法，根據(jù)GenBank上的禽傳染性支氣管炎病毒基因組序列，設(shè)計1對引物，建立了檢測IBV的一步法RT PCR方法，該方法對20份疑似傳染性支氣管炎（Infectiousbronchitis，IB）病料、傳染性法氏囊病毒（Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV）、新城疫病毒（Newcastaldiseasevirus，NDV）進(jìn)行檢測，結(jié)果僅IBV為陽性，IBDV、NDV均為陰性。該一步法RT PCR方法具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性，最低可檢測出約4pg的IBVRNA，將為IBV的病原檢測及分子流行病學(xué)調(diào)查等提供早期快速的診斷方法。

關(guān)鍵詞：禽傳染性支氣管炎病毒；RT PCR；檢測

中圖分類號：S831文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-273X（2014）03-0016-02

雞傳染性支氣管炎（Infectiousbronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞的呼吸、泌尿生殖和消化等系統(tǒng)[1]，常給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。IBV是單股正鏈RNA病毒，一般對病毒的擴(kuò)增都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，本試驗將RT PCR反應(yīng)中反轉(zhuǎn)錄和PCR兩個反應(yīng)所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一個反應(yīng)管中，同一反應(yīng)體系中一步完成從反轉(zhuǎn)錄到PCR的全部反應(yīng)，且擴(kuò)增產(chǎn)物可直接點樣電泳，此一步法操作簡便，降低操作過程中的污染幾率，目前已成為臨床上檢測和疾病診斷的一個重要發(fā)展方向[2]。

1材料與方法

1.1病毒

IBV、IBDV和NDV均由萊山區(qū)某公司生物工程中心保存；20份疑似IB病料采自萊山區(qū)某養(yǎng)殖場。

1.2主要試劑

EasyPureViralDNA/RNAKit和一步法RT PCR檢測試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上的禽傳染性支氣管炎病毒基因組序列設(shè)計引物。

F：5`-GGTATAGTGTGGGTTGCTG-3`，R：3`-CCTTAATACCTTCCTCATTC-5`，擴(kuò)增片段大小為459bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4病毒的增殖

經(jīng)尿囊腔接種0.2mL10倍稀釋的IBV，37℃培養(yǎng)，棄去24h內(nèi)死亡的，72h后收取尿囊液。

1.5病毒

RNA的提取參照EasyPureViralDNA/RNAKit說明書進(jìn)行。

1.6一步法

RT PCR的建立采取20 L的反應(yīng)體系，按照試劑盒介紹的方法進(jìn)行。在反應(yīng)體系中分別加入RNA Template1 L，F(xiàn)orwardGSP（10 M）0.4 L，ReverseGSP（10 M）0.4 L，2*One StepReactionMix10 L，TransScriptTMOne StepEnzymeMix0.4 L，RNase freeWater加至總體積20 L，采取的擴(kuò)增程序為94℃5min；94℃30S，55℃30s，72℃min30個循環(huán)；72℃10min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7特異性試驗

用建立的一步法RT PCR分別檢測IBV、IBDV和NDV，驗證該方法檢測IBV的特異性。

1.8敏感性驗證

將已定量的IBV毒株提取的RNA進(jìn)行10倍倍比稀釋，稀釋度分別為10 1～10 5，用建立的一步法RT PCR進(jìn)行檢測，驗證該方法的敏感性。

1.9田間試驗

采用建立的一步法RT PCR檢測方法，對大規(guī)模養(yǎng)殖場2013年采集的3批60份樣品進(jìn)行IBV監(jiān)測，疑似陽性則用雞胚分離鑒定，然后用IBV抗血清進(jìn)行中和試驗和瓊脂擴(kuò)散試驗以鑒定病毒。

2 結(jié)果與分析 2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，在459bp處可見特異性片段，大小與預(yù)期相符，見圖1。

2.2特異性的試驗結(jié)果用建立的一步法

RT PCR同時檢測IBV、IBDV和NDV，僅IBV可擴(kuò)增出約500bp的目的基因條帶，而IBDV和NDV及陰性對照均未擴(kuò)增出目的片段，見圖2。表明該方法特異性較好。

2.IBDV；3.NDV；4.為陰性對照

2.3 敏感性的試驗結(jié)果用建立的一步法

RT PCR最低可檢出稀釋度為10 4的病毒RNA，即約4 pg的IBV RNA，見圖3。

2.4田間試驗結(jié)果

2013年采集大規(guī)模養(yǎng)殖場采集的3批60份樣品進(jìn)行IBV監(jiān)測，采用所建立的一步法RT PCR檢測方法，篩選檢測陽性共5份，陽性率為8.33%。樣品經(jīng)雞胚分離鑒定，然后用IBV抗血清進(jìn)行中和試驗和ELISA試驗，結(jié)果完全符合。

3討論

近年來，傳染性支氣管炎病的流行出現(xiàn)了新的特點，其剖檢癥狀不典型，給臨床診斷帶來很大的困擾，而目前檢測IBV的常用實驗室方法有病毒分離[3]、瓊脂擴(kuò)散試驗[3]、ELISA[4]、RT PCR[5]，這些方法各有優(yōu)缺點：病原的分離鑒定是臨床上診斷IBV的重要方法，但是該方法操作繁瑣，檢測周期長[6]；瓊脂擴(kuò)撒試驗操作簡單，但敏感性不高，該方法一般多用于檢測IBV抗原，不推薦檢測IBV抗體[7]；ELISA檢測IBV的優(yōu)點比一般的血清學(xué)試驗均敏感，但此法的缺點不能區(qū)分抗體是何種毒株刺激機體產(chǎn)生的[1]；RT PCR技術(shù)具有靈敏、快速、特異性強、操作簡單等特點。

兩步法RT PCR反應(yīng)一般在PCR儀上先花費1.5h的反轉(zhuǎn)錄時間，再停機加入PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行下一步的PCR反應(yīng)，操作繁瑣，而且花費很多試劑準(zhǔn)備試劑、加樣。而一步法RT PCR技術(shù)只需將反應(yīng)中反轉(zhuǎn)錄和PCR兩個反應(yīng)所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一個反應(yīng)管中，同一反應(yīng)體系中一步完成從反轉(zhuǎn)錄到PCR的全部反應(yīng)，且擴(kuò)增產(chǎn)物可直接點樣電泳，此一步法操作簡便易行，而且最大限度地降低了外來因素的污染，更適合廣大基層大量樣品的快速檢測。

本研究根據(jù)IBV保守區(qū)序列設(shè)計1對引物，建立了檢測IBV的一步法RT PCR檢測方法，結(jié)果顯示該方法特異性好，靈敏度較高，為今后IB的快速診斷和病原學(xué)的研究提供了有力的工具。

參考文獻(xiàn)：

[1]BW卡爾尼克.禽病學(xué)[M].高 福，蘇敬良，譯.第10版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1999.

[2]廖 敏，謝芝勛，謝志勤，等.一步法RT PCR檢測禽呼腸孤病毒的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2003，25（1）：53 55.