不同位置土壤中枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力的比較

王佩+武亞方+盧江麗+劉夢潔

摘要：從月季花下、草坪上及大樹下采集土壤，然后對其進行分離得到枯草芽孢桿菌。通過對枯草芽苞桿菌利用酪蛋白培養基產蛋白酶能力的比較，發現月季花下土壤中分離得到的枯草芽孢桿菌產蛋白酶的能力最強。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；蛋白酶；純化

中圖分類號：S188文獻標識碼：A文章編號：1007-273X（2014）03-0012-02

隨著飼用酶制劑應用研究的不斷深入，人們逐漸發現了蛋白酶在動物營養上的獨特作用，蛋白酶也因此受到了越來越多的關注。根據來源的不同，蛋白酶可分為動物源性蛋白酶、植物源性蛋白酶、微生物源性蛋白酶等[1]。其中微生物蛋白酶既有通過細菌（如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌）培養提取的，也有通過真菌（如黑曲霉、酵母）發酵提取的。微生物蛋白酶和植物蛋白酶由于生產成本相對低廉，在多種工業（如飼料、食品等）上得到了廣泛應用。本試驗通過對不同位置的新鮮土壤進行分離，篩選出產蛋白酶活力較高的菌株，為微生物蛋白酶的研究奠定了基礎。

1材料與方法

1.1土壤

試驗用3份新鮮土壤：采自黃淮學院某月季花下、草坪上及大樹下，距土壤表層約10 cm。

1.2方法

1.2.1菌株分離 將土樣平攤于一干凈的四方紙上，從紙的四角及中間各取適量的土樣，混勻。稱取1.0 g混勻土樣與20 mL肉湯培養基于錐形瓶中混合，封口。再將其放入80 ℃恒溫水浴鍋中加熱處理10 min，然后于恒溫搖床內30 ℃，150 r/min振蕩培養24 h。

用接種環接種于營養瓊脂培養基上，30 ℃條件下培養24 h[2，3]。

1.2.2革蘭氏染色 將上述營養瓊脂培養基上的菌落進行涂片鏡檢。

在已干燥的抹片上滴加草酸銨結晶紫染色液，染色1 min，水洗；加路戈碘液進行媒染2 min，水洗；加95%乙醇進行脫色30 s，水洗；加10倍稀釋的石碳酸復紅染液，復染1 min，水洗；吸干、烘干，鏡檢。

1.2.3生化試驗

（1）接觸酶試驗。用接種環取一小環符合上述要求的菌落涂抹于已滴有10%過氧化氫溶液的載玻片上，觀察載玻片上是否有大量氣泡產生。

（2）V-P試驗。將符合上述要求的菌落接種于V-P反應培養液中，37 ℃培養4 d后，取2 mL培養液和等量的40%NaOH溶液混合，充分振蕩后觀察培養液是否呈紅色。

（3）水解淀粉試驗。取符合上述要求的菌落接種于淀粉培養基上，于37 ℃培養4 d后，在平板上滴加盧氏碘液（需鋪滿菌落），觀察平板是否呈藍色，菌落周圍有無無色透明圈出現。

（4）檸檬酸鹽試驗。將符合上述要求的菌落接種于檸檬酸鹽培養基上，37 ℃培養4 d，觀察平板是否呈現藍色或桃紅色。

（5）分解酪素試驗。將符合各個生化鑒定結果的菌落接種于肉湯培養基中，置于恒溫搖床機內30 ℃、150 r/min振蕩富集培養24 h。然后再將其置于80℃水浴鍋中加熱10 min。取1 mL處理液以10倍稀釋法分別稀釋為10 4、10 5、10 6。分別取0.1 mL菌液涂布于酪素培養基上。倒置于恒溫培養箱中30 ℃培養24 h。

觀察酪素平板上菌落周圍是否產生透明圈，挑H/C（透明圈直徑/菌落直徑）比值大的菌種接入斜面培養基上。30 ℃培養24 h，備用。

1.2.4菌種純化 平板劃線分離法在牛肉膏蛋白胨培養基上分離純化挑選出的菌株。

2結果與分析

2.1菌種分離

革蘭氏染色陽性；鏡檢結果為短桿狀、芽孢端生，形狀橢圓。

2.2菌種鑒定

生化試驗鑒定結果見表1。有表1可見，該菌對接觸酶試驗、V-P試驗、水解淀粉試驗、檸檬酸鹽試驗均呈陽性。

由表2可見，月季花下分離后菌株在酵素平板上的H/C值最大。該菌能分解酪素，在酪素平板上菌落周圍所形成的透明圈H/C結果見表2。

根據各項指標的檢測結果，依照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，可以認為篩選到的菌株為枯草芽孢桿菌[4]，其中月季花下純化的枯草芽孢桿菌產蛋白酶能力最強，草坪上純化的枯草芽孢桿菌產蛋白酶能力次之，大樹下純化的枯草芽孢桿菌產蛋白酶能力最弱。

3討論

催化蛋白質水解的酶種類很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢桿菌蛋白酶等。許多行業已開始大量利用蛋白酶，因為它既可以節省時間，又能改善勞動衛生條件。蛋白酶可用于蠶絲脫膠、肉類嫩化、酒類澄清等。臨床上可作藥用，如用胃蛋白酶治療消化不良，用酸性蛋白酶治療支氣管炎；加酶洗衣粉是洗滌劑中的新產品，含堿性蛋白酶，能去除衣物上的血漬和蛋白污物，但使用時應注意不要接觸皮膚，以免損傷皮膚表面的蛋白質，引起皮疹、濕疹等過敏現象。

本試驗通過對菌株分離、鑒定的研究，得到了產蛋白酶的枯草芽孢桿菌，為進一步提高該菌產中性蛋白酶的能力奠定了基礎，在接下來的試驗中，計劃篩選出高產蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株，并對其進行優化，提高酶活力，增強穩定性，使其作為酶制劑盡快應用于飼料添加劑產業。

參考文獻：

[1]郭興華，益生菌—基礎與應用[M].北京：北京科學技術出版社，2002.

[2]湯保貴，徐中文，張金燕，等.枯草芽孢桿菌的培養條件及對水質的凈化作用[J].淡水魚業，2007，37（3）：45 48.

[3]雷愛瑩.枯草芽孢桿菌的分離和凈化水質的研究[J].廣西農業科學，2005（3）：20 22.

[4]溫海燕.枯草芽孢桿菌的分離與初步鑒定[J].獸醫科技，2012（2）：118 119.

摘要：從月季花下、草坪上及大樹下采集土壤，然后對其進行分離得到枯草芽孢桿菌。通過對枯草芽苞桿菌利用酪蛋白培養基產蛋白酶能力的比較，發現月季花下土壤中分離得到的枯草芽孢桿菌產蛋白酶的能力最強。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；蛋白酶；純化

中圖分類號：S188文獻標識碼：A文章編號：1007-273X（2014）03-0012-02

隨著飼用酶制劑應用研究的不斷深入，人們逐漸發現了蛋白酶在動物營養上的獨特作用，蛋白酶也因此受到了越來越多的關注。根據來源的不同，蛋白酶可分為動物源性蛋白酶、植物源性蛋白酶、微生物源性蛋白酶等[1]。其中微生物蛋白酶既有通過細菌（如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌）培養提取的，也有通過真菌（如黑曲霉、酵母）發酵提取的。微生物蛋白酶和植物蛋白酶由于生產成本相對低廉，在多種工業（如飼料、食品等）上得到了廣泛應用。本試驗通過對不同位置的新鮮土壤進行分離，篩選出產蛋白酶活力較高的菌株，為微生物蛋白酶的研究奠定了基礎。

1材料與方法

1.1土壤

試驗用3份新鮮土壤：采自黃淮學院某月季花下、草坪上及大樹下，距土壤表層約10 cm。

1.2方法

1.2.1菌株分離 將土樣平攤于一干凈的四方紙上，從紙的四角及中間各取適量的土樣，混勻。稱取1.0 g混勻土樣與20 mL肉湯培養基于錐形瓶中混合，封口。再將其放入80 ℃恒溫水浴鍋中加熱處理10 min，然后于恒溫搖床內30 ℃，150 r/min振蕩培養24 h。

用接種環接種于營養瓊脂培養基上，30 ℃條件下培養24 h[2，3]。

1.2.2革蘭氏染色 將上述營養瓊脂培養基上的菌落進行涂片鏡檢。

在已干燥的抹片上滴加草酸銨結晶紫染色液，染色1 min，水洗；加路戈碘液進行媒染2 min，水洗；加95%乙醇進行脫色30 s，水洗；加10倍稀釋的石碳酸復紅染液，復染1 min，水洗；吸干、烘干，鏡檢。

1.2.3生化試驗

（1）接觸酶試驗。用接種環取一小環符合上述要求的菌落涂抹于已滴有10%過氧化氫溶液的載玻片上，觀察載玻片上是否有大量氣泡產生。

（2）V-P試驗。將符合上述要求的菌落接種于V-P反應培養液中，37 ℃培養4 d后，取2 mL培養液和等量的40%NaOH溶液混合，充分振蕩后觀察培養液是否呈紅色。

（3）水解淀粉試驗。取符合上述要求的菌落接種于淀粉培養基上，于37 ℃培養4 d后，在平板上滴加盧氏碘液（需鋪滿菌落），觀察平板是否呈藍色，菌落周圍有無無色透明圈出現。

（4）檸檬酸鹽試驗。將符合上述要求的菌落接種于檸檬酸鹽培養基上，37 ℃培養4 d，觀察平板是否呈現藍色或桃紅色。

（5）分解酪素試驗。將符合各個生化鑒定結果的菌落接種于肉湯培養基中，置于恒溫搖床機內30 ℃、150 r/min振蕩富集培養24 h。然后再將其置于80℃水浴鍋中加熱10 min。取1 mL處理液以10倍稀釋法分別稀釋為10 4、10 5、10 6。分別取0.1 mL菌液涂布于酪素培養基上。倒置于恒溫培養箱中30 ℃培養24 h。

觀察酪素平板上菌落周圍是否產生透明圈，挑H/C（透明圈直徑/菌落直徑）比值大的菌種接入斜面培養基上。30 ℃培養24 h，備用。

1.2.4菌種純化 平板劃線分離法在牛肉膏蛋白胨培養基上分離純化挑選出的菌株。

2結果與分析

2.1菌種分離

革蘭氏染色陽性；鏡檢結果為短桿狀、芽孢端生，形狀橢圓。

2.2菌種鑒定

生化試驗鑒定結果見表1。有表1可見，該菌對接觸酶試驗、V-P試驗、水解淀粉試驗、檸檬酸鹽試驗均呈陽性。

由表2可見，月季花下分離后菌株在酵素平板上的H/C值最大。該菌能分解酪素，在酪素平板上菌落周圍所形成的透明圈H/C結果見表2。

根據各項指標的檢測結果，依照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，可以認為篩選到的菌株為枯草芽孢桿菌[4]，其中月季花下純化的枯草芽孢桿菌產蛋白酶能力最強，草坪上純化的枯草芽孢桿菌產蛋白酶能力次之，大樹下純化的枯草芽孢桿菌產蛋白酶能力最弱。

3討論

催化蛋白質水解的酶種類很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢桿菌蛋白酶等。許多行業已開始大量利用蛋白酶，因為它既可以節省時間，又能改善勞動衛生條件。蛋白酶可用于蠶絲脫膠、肉類嫩化、酒類澄清等。臨床上可作藥用，如用胃蛋白酶治療消化不良，用酸性蛋白酶治療支氣管炎；加酶洗衣粉是洗滌劑中的新產品，含堿性蛋白酶，能去除衣物上的血漬和蛋白污物，但使用時應注意不要接觸皮膚，以免損傷皮膚表面的蛋白質，引起皮疹、濕疹等過敏現象。

本試驗通過對菌株分離、鑒定的研究，得到了產蛋白酶的枯草芽孢桿菌，為進一步提高該菌產中性蛋白酶的能力奠定了基礎，在接下來的試驗中，計劃篩選出高產蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株，并對其進行優化，提高酶活力，增強穩定性，使其作為酶制劑盡快應用于飼料添加劑產業。

參考文獻：

[1]郭興華，益生菌—基礎與應用[M].北京：北京科學技術出版社，2002.

[2]湯保貴，徐中文，張金燕，等.枯草芽孢桿菌的培養條件及對水質的凈化作用[J].淡水魚業，2007，37（3）：45 48.

[3]雷愛瑩.枯草芽孢桿菌的分離和凈化水質的研究[J].廣西農業科學，2005（3）：20 22.

[4]溫海燕.枯草芽孢桿菌的分離與初步鑒定[J].獸醫科技，2012（2）：118 119.

摘要：從月季花下、草坪上及大樹下采集土壤，然后對其進行分離得到枯草芽孢桿菌。通過對枯草芽苞桿菌利用酪蛋白培養基產蛋白酶能力的比較，發現月季花下土壤中分離得到的枯草芽孢桿菌產蛋白酶的能力最強。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；蛋白酶；純化

中圖分類號：S188文獻標識碼：A文章編號：1007-273X（2014）03-0012-02

隨著飼用酶制劑應用研究的不斷深入，人們逐漸發現了蛋白酶在動物營養上的獨特作用，蛋白酶也因此受到了越來越多的關注。根據來源的不同，蛋白酶可分為動物源性蛋白酶、植物源性蛋白酶、微生物源性蛋白酶等[1]。其中微生物蛋白酶既有通過細菌（如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌）培養提取的，也有通過真菌（如黑曲霉、酵母）發酵提取的。微生物蛋白酶和植物蛋白酶由于生產成本相對低廉，在多種工業（如飼料、食品等）上得到了廣泛應用。本試驗通過對不同位置的新鮮土壤進行分離，篩選出產蛋白酶活力較高的菌株，為微生物蛋白酶的研究奠定了基礎。

1材料與方法

1.1土壤

試驗用3份新鮮土壤：采自黃淮學院某月季花下、草坪上及大樹下，距土壤表層約10 cm。

1.2方法

1.2.1菌株分離 將土樣平攤于一干凈的四方紙上，從紙的四角及中間各取適量的土樣，混勻。稱取1.0 g混勻土樣與20 mL肉湯培養基于錐形瓶中混合，封口。再將其放入80 ℃恒溫水浴鍋中加熱處理10 min，然后于恒溫搖床內30 ℃，150 r/min振蕩培養24 h。

用接種環接種于營養瓊脂培養基上，30 ℃條件下培養24 h[2，3]。

1.2.2革蘭氏染色 將上述營養瓊脂培養基上的菌落進行涂片鏡檢。

在已干燥的抹片上滴加草酸銨結晶紫染色液，染色1 min，水洗；加路戈碘液進行媒染2 min，水洗；加95%乙醇進行脫色30 s，水洗；加10倍稀釋的石碳酸復紅染液，復染1 min，水洗；吸干、烘干，鏡檢。

1.2.3生化試驗

（1）接觸酶試驗。用接種環取一小環符合上述要求的菌落涂抹于已滴有10%過氧化氫溶液的載玻片上，觀察載玻片上是否有大量氣泡產生。

（2）V-P試驗。將符合上述要求的菌落接種于V-P反應培養液中，37 ℃培養4 d后，取2 mL培養液和等量的40%NaOH溶液混合，充分振蕩后觀察培養液是否呈紅色。

（3）水解淀粉試驗。取符合上述要求的菌落接種于淀粉培養基上，于37 ℃培養4 d后，在平板上滴加盧氏碘液（需鋪滿菌落），觀察平板是否呈藍色，菌落周圍有無無色透明圈出現。

（4）檸檬酸鹽試驗。將符合上述要求的菌落接種于檸檬酸鹽培養基上，37 ℃培養4 d，觀察平板是否呈現藍色或桃紅色。

（5）分解酪素試驗。將符合各個生化鑒定結果的菌落接種于肉湯培養基中，置于恒溫搖床機內30 ℃、150 r/min振蕩富集培養24 h。然后再將其置于80℃水浴鍋中加熱10 min。取1 mL處理液以10倍稀釋法分別稀釋為10 4、10 5、10 6。分別取0.1 mL菌液涂布于酪素培養基上。倒置于恒溫培養箱中30 ℃培養24 h。

觀察酪素平板上菌落周圍是否產生透明圈，挑H/C（透明圈直徑/菌落直徑）比值大的菌種接入斜面培養基上。30 ℃培養24 h，備用。

1.2.4菌種純化 平板劃線分離法在牛肉膏蛋白胨培養基上分離純化挑選出的菌株。

2結果與分析

2.1菌種分離

革蘭氏染色陽性；鏡檢結果為短桿狀、芽孢端生，形狀橢圓。

2.2菌種鑒定

生化試驗鑒定結果見表1。有表1可見，該菌對接觸酶試驗、V-P試驗、水解淀粉試驗、檸檬酸鹽試驗均呈陽性。

由表2可見，月季花下分離后菌株在酵素平板上的H/C值最大。該菌能分解酪素，在酪素平板上菌落周圍所形成的透明圈H/C結果見表2。

根據各項指標的檢測結果，依照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，可以認為篩選到的菌株為枯草芽孢桿菌[4]，其中月季花下純化的枯草芽孢桿菌產蛋白酶能力最強，草坪上純化的枯草芽孢桿菌產蛋白酶能力次之，大樹下純化的枯草芽孢桿菌產蛋白酶能力最弱。

3討論

催化蛋白質水解的酶種類很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢桿菌蛋白酶等。許多行業已開始大量利用蛋白酶，因為它既可以節省時間，又能改善勞動衛生條件。蛋白酶可用于蠶絲脫膠、肉類嫩化、酒類澄清等。臨床上可作藥用，如用胃蛋白酶治療消化不良，用酸性蛋白酶治療支氣管炎；加酶洗衣粉是洗滌劑中的新產品，含堿性蛋白酶，能去除衣物上的血漬和蛋白污物，但使用時應注意不要接觸皮膚，以免損傷皮膚表面的蛋白質，引起皮疹、濕疹等過敏現象。

本試驗通過對菌株分離、鑒定的研究，得到了產蛋白酶的枯草芽孢桿菌，為進一步提高該菌產中性蛋白酶的能力奠定了基礎，在接下來的試驗中，計劃篩選出高產蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株，并對其進行優化，提高酶活力，增強穩定性，使其作為酶制劑盡快應用于飼料添加劑產業。

參考文獻：

[1]郭興華，益生菌—基礎與應用[M].北京：北京科學技術出版社，2002.

[2]湯保貴，徐中文，張金燕，等.枯草芽孢桿菌的培養條件及對水質的凈化作用[J].淡水魚業，2007，37（3）：45 48.

[3]雷愛瑩.枯草芽孢桿菌的分離和凈化水質的研究[J].廣西農業科學，2005（3）：20 22.

[4]溫海燕.枯草芽孢桿菌的分離與初步鑒定[J].獸醫科技，2012（2）：118 119.