高產纖維素酶菌株的微波誘變及篩選研究

王強強+莫海飛+董靜+張利+伍紅

摘要：為了能夠選育出一株高產纖維素酶的優良菌株，采用微波對其孢子懸液進行不同時間的輻照處理后，篩選出一株能高產纖維素酶的突變菌株B40 1，在最適產酶條件下，該突變菌株所產纖維素酶的濾紙酶活力和羧甲基纖維素酶活力分別是出發菌株的169.9%、110.0%。

關鍵字：里氏木霉；纖維素酶；微波誘變；酶活力

中圖分類號：S852.6文獻標識碼：A文章編號：1007-273x（2014）03-0005-03

纖維素是地球上最豐富且最廉價的可再生資源之一，棉、木、麻及各種秸稈中均含有豐富的纖維素。目前已經得到的纖維素酶仍不能滿足工業生產的需要，所以尋找新的適于再生能源需要的高催化活性、低成本的纖維素酶，依舊是此后的研究熱點[1 3]。尋找和開發高產纖維素酶新菌種，選育出纖維素酶高產優良菌株是纖維素資源能否高效利用的關鍵問題，也是今后纖維素酶高產菌選育研究的一項重要任務，具有非常重要的生態效益、經濟效益和社會意義[4 7]。

微波是一種高頻電磁波，能夠對一些極性分子如水分子、蛋白質、核苷酸、碳水化合物等產生快速震動的刺激作用，使細胞內DNA分子氫鍵和堿基堆積化學力受到損傷，引起DNA結構發生改變，從而發生遺傳變異[8]。本試驗以里氏木霉Rutc30為出發菌株，經微波輻照處理，最終選育出一株高產纖維素酶的里氏木霉突變菌株B40 1。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種 里氏木霉菌株（TrichodermareeseiRutc30），由本實驗室保存。

1.1.2主要儀器 ODELGSKP 01BII型隔水式電熱恒溫培養箱（湖北省黃石市醫療器械廠）；HZQ CV型空氣振蕩培養箱（哈爾濱市東明醫療儀器廠）；UV 6100型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；家用微波爐（額定輸出功率800 W，脈沖頻率2450 MHz）；ST16R型臺式高速冷凍離心機Thermo（德國）。

1.1.3主要試劑 ①DNS試劑：3，5 二硝基水楊酸5.3 g，NaOH 9.9 g，酒石酸鉀鈉153 g，無水亞硫酸鈉4.15 g，苯酚3.8 mL，蒸餾水708 mL；②葡萄糖標準溶液：稱取葡萄糖0.036 g，蒸餾水定容至100 mL；③0.05 mol/mL，pH 4.8的檬酸 檸檬酸鈉緩沖液：無水檸檬酸9.6 g，無水檸檬酸鈉16.1186 g，蒸餾水定容至100 mL等。

1.1.4培養基 ①土豆培養基：馬鈴薯20 g，葡萄糖2 g，瓊脂2 g，自來水定容至100 mL，pH自然；②分離培養基：KH2PO4 0.100 g，MgSO4·7H2O 0.025 g，（NH4）2SO4 1.000 g，CMC Na 1.000 g，去氧膽酸納0.250 g，剛果紅0.020 g，瓊脂2.000 g，蒸餾水定容至100 mL，pH自然；③MM培養基：葡萄糖20 g，（NH4）2SO4 5.0 g，KH2PO415 g，MgSO4·7H2O20.6 g，CaCl2 0.453 1 g，CoCl2·6H20 3.7mg，FeSO4·7H2O 5 mg，ZnSO4·7H2O1.4mg，MnSO4·H2O1.6mg，加蒸餾水至1 000 mL，pH自然。

1.2方法

1.2.1葡萄糖標準曲線 取6支10 mL試管，分別加入相應試劑，于沸水浴中顯色5 min，取出后用冰水迅速冷卻，加入蒸餾水至5 mL，搖勻靜置，于540 nm波長處測定光吸收值。以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標，以OD值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線[9]。

1.2.2菌株的活化、培養與孢子懸液制備 刮取冷凍里氏木霉菌絲少許，轉至盛有0.85%生理鹽水的試管內，40 ℃水浴振蕩復蘇100 s；吸取適量菌液平板涂布，30 ℃恒溫培養4 d；用pH為7.0的磷酸緩沖液沖洗下孢子，180 r/min，30℃恒溫振蕩30 min，使孢子充分活化并分散；用血球計數板進行計數，最后用相同濃度的生理鹽水將孢子懸液稀釋至106個/mL[8 11]。

1.2.3微波誘變 微波爐調至最大功率800 W，額定頻率2 450 MHz。按不同的輻照時間對孢子懸浮液進行處理后，冰水浴1 min以消除微波熱效應，取輻照后的孢子懸液涂布于分離培養基平板上，30 ℃恒溫培養5d后進行菌落計數，同時計算微波不同輻照時間下的致死率[8，12]。致死率=（對照菌落數 處理菌落數）/對照菌落數×100%。

1.2.4突變菌株的篩選及擴大培養 篩選培養5 d后，挑選透明圈與菌落直徑之比大于2.0（H/C>2.0）、生長較快且產孢豐滿的菌落，接種到MM培養基中，180 r/min，30 ℃恒溫培養72 h。稱取菌絲1 g（濕重）接種于產酶培養基中，相同條件下培養5 d。取適量培養液于4 ℃，6 000 r/min離心10 min，將上清液移至新的EP管中，備用[8，13 15]。

1.2.5纖維素酶活力測定 ①取適量原菌株酶液，沸水浴中處理5 min，為對照組備用；②FPA活力測定：將新華濾紙裁成6 cm×1 cm的長方形，卷成圓筒狀置于50 mL試管中，加入0.05 mol/mL、pH 4.8的檸檬酸 檸檬酸鈉緩沖液1.5 mL，加酶液0.5 mL（空白先不加），50℃水浴平衡60 min后，加3 mLDNS試劑，沸水浴10 min后冰水中迅速冷卻，補加蒸餾水至25 mL，搖勻靜置，于540 nm處測吸光值。③羧甲基纖維素酶活力測定：在50 mL試管中先各加入1%CMC溶液0.5 mL，再加入0.5 mL酶液（空白先不加），50 ℃保溫30 min后，加入2.0 mLDNS試劑，水浴煮沸5min，冰水迅速冷卻后加蒸餾水至10 mL，混勻靜置，在540 nm處測OD值[9，15]。

纖維素酶活定義：在50℃條件下，每毫升樣品每小時水解生成1mg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位。

2結果與分析

2.1葡萄糖標準曲線

從圖1可知，葡萄糖標準曲線y=0.002 3x 0.015，線性相關系數R2=0.997 8，線性較好，可以用于纖維素酶活力的測定。

2.2微波對里氏木霉Rutc30的孢子懸液致死率

以里氏木霉Ritc30為出發菌株，選用輸出功率800W，額定頻率2450MHz的微波對其孢子懸浮液進行輻照處理，輻照時間分別是10、20、40、60、80、100 s后，孢子致死率與輻照時間關系見表1、圖2。

從表1、圖2中可知，微波輻照處理里氏木霉孢子懸液20 s時，致死率達81.2%，當輻照時間為80 s時，致死率為95.8%，100 s處理時，致死率接近100%。說明里氏木霉Ritc30的孢子對微波極為敏感。

從表1、圖2中可知，微波輻照處理里氏木霉孢子懸液20s時，致死率達81.2%，當輻照時間為80 s時，致死率為95.8%，100 s處理時，致死率接近100%。說明里氏木霉Ritc30的孢子對微波極為敏感。

2.2微波誘變后突變菌株的篩選及其產酶活力的鑒定

微波誘變后，在分離培養基平板上挑選纖維素水解圈與菌落直徑之比大于2.0（ H/C>2.0）、選擇生長較快且孢子豐滿的6株菌株，編號后對其搖瓶擴大培養，測定突變菌株產纖維素酶的酶活力，以鑒定突變菌株的產酶性能，結果見表2。

從表2可知，挑選出的6株突變菌株，其所產纖維素酶的濾紙酶活力均高于原出發菌株，相對FPA活力為127.7%～169.9%。綜合CMCase活力測定結果，最終選育出一株高產纖維素酶的菌株B40 1。其相對FPA活力、CMCase活力分別為169.9%、110.0%。

3小結與討論

通過本試驗，可知以微波作為菌株誘變方法是可行的，且具有較好的誘變效果；運用冰水浴法，對輻射后的孢子懸液冰水浴處理，極大程度上消除了微波熱效應對試驗的影響，從而使孢子懸液誘變過程中，溫度始終保持在一個相對穩定的水平。由此建立了微波誘變方法。

通過本試驗的研究發現，當輻射時間為20 s時，致死率為81.2%，說明里氏木霉Rutc30對微波極為敏感，同時確定微波誘變的最佳時間為40s。篩選出的突變菌株B40 1，其所產纖維素酶的濾紙酶活力達到3.061 U，是原出發菌株所產纖維素酶活力的1.7倍。

在試驗過程中發現經微波誘變后的菌株生長較原菌株快很多，但菌絲高度較原菌株矮，其機理有待進一步的探討。

參考文獻：

[1]李燕紅，趙輔昆.纖維素酶的研究進展[J].生命科學，2005，17（5）：392 397.

[2]李 豪，車振明.微波誘變生物育種的研究[J].山西食品工業，2005（2）：5 14。

[3]CHAND P，ARUNA A，MAQSOOD A M，et al.Novel mutation method forincrease cellulose production[J].The Society for Applied Microbiology，2004，98：318 323.

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[8]蘭時樂，李立恒，王 晶，等.微波誘變結合化學誘變選育纖維素酶高產菌的研究[J].微生物學雜志2007，27（1）：20 25.

[9]顏秋生，蔣傳葵.纖維素酶制劑活力的測定方法[J].遺傳，1979（3）：33 34.

[10] 范志華，張陳云，劉金福，等.培養條件對里氏木霉產纖維素酶的影響[J].天津農學院學報，2005，12（2）：18 21.

[11] 沈 萍，劉向東.微生物學[M].第2版.北京：高等教育出版社，2000.

[12] 侯紅萍，杜文娟.微波誘變篩選纖維素酶高產菌株[J].中國釀造，2008，（24）：44 46.

[13] 董志揚，祝令香，于 巍.等.纖維素酶高產菌株的誘變選育及其產酶條件研究[J].核農學報，2001，15（1）：26 31.

[14] 伍 紅，秦天鶯，譚德勇，等.瑞氏木霉QM9414利用蔗渣發酵產纖維素酶的研究[J].云南大學學報（自然科學版）.2008，30（6）：620 624.

[15] 張瑞萍.纖維素酶的濾紙酶活和CMC酶活的測定[J].印染助劑，2002，19（5）：52 53.

纖維素酶活定義：在50℃條件下，每毫升樣品每小時水解生成1mg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位。

2結果與分析

2.1葡萄糖標準曲線

從圖1可知，葡萄糖標準曲線y=0.002 3x 0.015，線性相關系數R2=0.997 8，線性較好，可以用于纖維素酶活力的測定。

2.2微波對里氏木霉Rutc30的孢子懸液致死率

以里氏木霉Ritc30為出發菌株，選用輸出功率800W，額定頻率2450MHz的微波對其孢子懸浮液進行輻照處理，輻照時間分別是10、20、40、60、80、100 s后，孢子致死率與輻照時間關系見表1、圖2。

從表1、圖2中可知，微波輻照處理里氏木霉孢子懸液20 s時，致死率達81.2%，當輻照時間為80 s時，致死率為95.8%，100 s處理時，致死率接近100%。說明里氏木霉Ritc30的孢子對微波極為敏感。

從表1、圖2中可知，微波輻照處理里氏木霉孢子懸液20s時，致死率達81.2%，當輻照時間為80 s時，致死率為95.8%，100 s處理時，致死率接近100%。說明里氏木霉Ritc30的孢子對微波極為敏感。

2.2微波誘變后突變菌株的篩選及其產酶活力的鑒定

微波誘變后，在分離培養基平板上挑選纖維素水解圈與菌落直徑之比大于2.0（ H/C>2.0）、選擇生長較快且孢子豐滿的6株菌株，編號后對其搖瓶擴大培養，測定突變菌株產纖維素酶的酶活力，以鑒定突變菌株的產酶性能，結果見表2。

從表2可知，挑選出的6株突變菌株，其所產纖維素酶的濾紙酶活力均高于原出發菌株，相對FPA活力為127.7%～169.9%。綜合CMCase活力測定結果，最終選育出一株高產纖維素酶的菌株B40 1。其相對FPA活力、CMCase活力分別為169.9%、110.0%。

3小結與討論

通過本試驗，可知以微波作為菌株誘變方法是可行的，且具有較好的誘變效果；運用冰水浴法，對輻射后的孢子懸液冰水浴處理，極大程度上消除了微波熱效應對試驗的影響，從而使孢子懸液誘變過程中，溫度始終保持在一個相對穩定的水平。由此建立了微波誘變方法。

通過本試驗的研究發現，當輻射時間為20 s時，致死率為81.2%，說明里氏木霉Rutc30對微波極為敏感，同時確定微波誘變的最佳時間為40s。篩選出的突變菌株B40 1，其所產纖維素酶的濾紙酶活力達到3.061 U，是原出發菌株所產纖維素酶活力的1.7倍。

在試驗過程中發現經微波誘變后的菌株生長較原菌株快很多，但菌絲高度較原菌株矮，其機理有待進一步的探討。

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纖維素酶活定義：在50℃條件下，每毫升樣品每小時水解生成1mg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位。

2結果與分析

2.1葡萄糖標準曲線

從圖1可知，葡萄糖標準曲線y=0.002 3x 0.015，線性相關系數R2=0.997 8，線性較好，可以用于纖維素酶活力的測定。

2.2微波對里氏木霉Rutc30的孢子懸液致死率

以里氏木霉Ritc30為出發菌株，選用輸出功率800W，額定頻率2450MHz的微波對其孢子懸浮液進行輻照處理，輻照時間分別是10、20、40、60、80、100 s后，孢子致死率與輻照時間關系見表1、圖2。

從表1、圖2中可知，微波輻照處理里氏木霉孢子懸液20 s時，致死率達81.2%，當輻照時間為80 s時，致死率為95.8%，100 s處理時，致死率接近100%。說明里氏木霉Ritc30的孢子對微波極為敏感。

從表1、圖2中可知，微波輻照處理里氏木霉孢子懸液20s時，致死率達81.2%，當輻照時間為80 s時，致死率為95.8%，100 s處理時，致死率接近100%。說明里氏木霉Ritc30的孢子對微波極為敏感。

2.2微波誘變后突變菌株的篩選及其產酶活力的鑒定

微波誘變后，在分離培養基平板上挑選纖維素水解圈與菌落直徑之比大于2.0（ H/C>2.0）、選擇生長較快且孢子豐滿的6株菌株，編號后對其搖瓶擴大培養，測定突變菌株產纖維素酶的酶活力，以鑒定突變菌株的產酶性能，結果見表2。

從表2可知，挑選出的6株突變菌株，其所產纖維素酶的濾紙酶活力均高于原出發菌株，相對FPA活力為127.7%～169.9%。綜合CMCase活力測定結果，最終選育出一株高產纖維素酶的菌株B40 1。其相對FPA活力、CMCase活力分別為169.9%、110.0%。

3小結與討論

通過本試驗，可知以微波作為菌株誘變方法是可行的，且具有較好的誘變效果；運用冰水浴法，對輻射后的孢子懸液冰水浴處理，極大程度上消除了微波熱效應對試驗的影響，從而使孢子懸液誘變過程中，溫度始終保持在一個相對穩定的水平。由此建立了微波誘變方法。

通過本試驗的研究發現，當輻射時間為20 s時，致死率為81.2%，說明里氏木霉Rutc30對微波極為敏感，同時確定微波誘變的最佳時間為40s。篩選出的突變菌株B40 1，其所產纖維素酶的濾紙酶活力達到3.061 U，是原出發菌株所產纖維素酶活力的1.7倍。

在試驗過程中發現經微波誘變后的菌株生長較原菌株快很多，但菌絲高度較原菌株矮，其機理有待進一步的探討。

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