響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取桑葚酒渣總黃酮的工藝

（韓山師范學(xué)院生物學(xué)系，廣東潮州 521041）

桑葚又叫桑果、桑棗，味甜多汁、風(fēng)味獨(dú)特、富含營(yíng)養(yǎng)，具有增強(qiáng)免疫，促進(jìn)造血細(xì)胞生長(zhǎng)，抗誘變，抗衰老，降血糖，降血脂和護(hù)肝等多種藥理作用，于1993年被衛(wèi)生部列為既是食品又是藥品的水果，屬于衛(wèi)生部規(guī)定的開(kāi)發(fā)功能食品的原料[1-3]。黃酮是一類廣泛存在于植物中的多酚類物質(zhì)，是植物在自然選擇過(guò)程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、開(kāi)花、結(jié)果、抵御異物的侵襲起著重要作用。研究表明，黃酮在動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)出廣泛的生物活性，不僅具有抗癌、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗過(guò)敏以及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用，還具有抑制血小板凝集和改善毛細(xì)管的滲透性及脆性的生理功能[4-5]。超聲波輔助提取法提取黃酮是目前較新的提取方法，是利用超聲波的空化作用破壞植物細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而加強(qiáng)黃酮類物質(zhì)的釋放與溶出，超聲波使提取液不斷震蕩，有助于溶劑的滲入與溶質(zhì)的擴(kuò)散，顯著提高了桑葚酒渣總黃酮的提取率[6]。本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)桑葚酒渣中總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為桑葚酒渣中總黃酮超聲波輔助提取提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚酒渣：將購(gòu)于潮州楓春水果批發(fā)市場(chǎng)的桑葚進(jìn)行果酒發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后用雙層紗布將酒渣壓榨過(guò)濾，將濾渣在60℃條件下真空干燥6 h，并用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)30目篩，得預(yù)處理后的桑葚酒渣，冷藏備用。

95%食用酒精、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：汕頭西隴化工有限公司；蘆丁（生化試劑）：國(guó)家藥品生物制品檢定所制；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；超聲波清洗器SB5200TDT：寧波新芝生物科技股份有限公司；電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；YK-12風(fēng)速中藥粉碎機(jī)：山東省青州市益康中藥機(jī)械有限公司；離心機(jī)：湖南湘儀有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁濃度及吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作[7-8]

精密稱取經(jīng)120℃干燥至恒重蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用50%乙醇溶解，搖勻并定容至50 mL，配制為0.1 g/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為貯備液備用。分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 25 mL 容量瓶中，用50%乙醇稀釋至10 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入1mol/L NaOH溶液2 mL，用50%乙醇定容，混合后搖勻，放置15 min，以試劑空白為參比，于510 nm處測(cè)吸光度值。以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=8.002 4C-0.000 8，R2=0.999 7。

1.3.2 超聲波工藝流程及總黃酮提取率測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.000 g的桑葚酒渣粉于250 mL錐形瓶中，加入一定體積的乙醇溶液搖勻，用保鮮膜將瓶口封住后浸泡3 h，然后采用超聲波提取一定時(shí)間，抽濾，濾液用50%乙醇定容至100 mL，作為待測(cè)液。準(zhǔn)確吸待測(cè)液1 mL于25 mL的容量瓶中，照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品總黃酮的提取率。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以原料總黃酮提取率為測(cè)定指標(biāo)，選用不同濃度的乙醇溶液、提取溫度、料液比、超聲波功率及提取時(shí)間作為影響因素，在保持其他因素不變的條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)原料總黃酮提取率的影響，篩選最佳提取工藝。

1.3.4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)[9-10]

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用5因素3水平響相應(yīng)面法分析桑葚酒渣總黃酮提取條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析[9]

二次多項(xiàng)式回歸分析和方差分析由Design Expert 7.0軟件完成。

表1 桑葚酒渣總黃酮響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels tested in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)桑葚總黃酮提取率的影響

分別采用濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇為提取溶劑，在提取溫度60℃、料液比1∶30（g/mL）、超聲波功率350 W、提取時(shí)間80 min的條件下用超聲波輔助法提取桑椹酒渣總黃酮，考察乙醇濃度對(duì)桑葚總黃酮提取率的影響。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)桑葚酒渣總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)桑椹酒渣總黃酮的提取率有顯著影響，乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，可引起細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化，脂溶性黃酮類化合物的溶解性也增大，有利于黃酮的提取，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)提取率達(dá)到最高點(diǎn)，而后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率降低。因此乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)總黃酮的提取率最佳。

2.1.2 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

以70%乙醇為提取溶劑，在料液比1∶30（g/mL），超聲波功率350 W，提取時(shí)間為80 min，提取溫度分別設(shè)置為 40、50、60、70、80、90 ℃，考察超聲溫度對(duì)桑椹酒渣總黃酮提取率的影響。由圖2可知，在超聲溫度低于70℃時(shí)，隨著溫度的升高，總黃酮的提取率有顯著提高，溫度高于70℃后，隨著溫度的升高總黃酮提取率趨于下降。這是因?yàn)樵谳^低溫度下，物質(zhì)分子熱能較低，不利于活性物質(zhì)溶出；當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，一些熱敏性組分被破壞，另外高溫條件下超聲振動(dòng)也破壞活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致總黃酮提取率下降，因而超聲溫度應(yīng)選擇70℃最佳[11-12]。

圖2 超聲溫度對(duì)桑葚酒渣總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extraction temperature on extraction rate of total flavonoids

2.1.3 料液比對(duì)總黃酮得率的影響

以70%乙醇為提取溶劑，在提取溫度70℃、超聲波功率350 W、提取時(shí)間80 min的條件下，分別采用料液比為 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL），考察料液比對(duì)桑椹酒渣總黃酮提取率的影響。

圖3 料液比對(duì)桑葚酒渣總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，料液比對(duì)桑椹酒渣總黃酮提取率有影響，當(dāng)料液比小于1∶30（g/mL）時(shí)，提取率隨著料液比的增加而增加。由于有效成分濃度梯度增大，擴(kuò)散速率提高，有利于提取率的提高，當(dāng)料液比超過(guò)1∶30（g/mL）后提取率開(kāi)始下降，而且料液比的增加將會(huì)加大后期濃縮的時(shí)間和能耗，所以選擇料液比1 ∶30（g/mL）最佳。

2.1.4 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響

以70%乙醇為提取溶劑，在提取溫度70℃、料液比 1∶30（g/mL）、超聲時(shí)間 80 min的條件下，分別采用超聲波功率為 200、250、300、350、400 W，考察超聲波功率對(duì)桑椹酒渣總黃酮提取率的影響。由圖4可知，在200 W～350 W之間，隨著超聲功率的增大，總黃酮的提取率也逐漸增加，當(dāng)超聲功率達(dá)到350 W之后，總黃酮提取率開(kāi)始下降，而且繼續(xù)增加超聲功率也會(huì)增加能源的消耗。因此，超聲功率選擇350 W為宜[13]。

2.1.5 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

以70%乙醇為提取溶劑，在超聲溫度70℃、料液比1∶30（g/mL）、超聲波功率350 W的條件下，分別提取 20、40、60、80、100 min，考察超聲時(shí)間對(duì)桑椹酒渣總黃酮提取率的影響。

圖4 超聲波功率對(duì)桑葚酒渣總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasomic power on extraction rate of total flavonoids

圖5 超聲時(shí)間對(duì)桑葚酒渣總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic extraction time on extraction rate of total flavonoids

由圖5可知，在超聲時(shí)間為20 min～80 min之間，隨著提取時(shí)間的增大，總黃酮的提取率也逐漸增加，當(dāng)提取達(dá)到80 min之后，總黃酮提取率增加幅度不大，繼續(xù)增加提取時(shí)間反而會(huì)降低總黃酮的溶出。因此，超聲時(shí)間選擇80 min為宜。

2.2 方差分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

以乙醇濃度（A）、超聲溫度（B）、料液比（C）、超聲波功率（D）、超聲時(shí)間（E）為自變量，以桑葚酒渣總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行設(shè)計(jì)試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 超聲波輔助提取桑葚酒渣總黃酮工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for surface analysis

續(xù)表2 超聲波輔助提取桑葚酒渣總黃酮工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2 Experimental design and results for surface analysis

2.2.2 二次相應(yīng)面回歸模型的建立與方差分析

采用Design-Expert 7.0軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析。為了得到更精簡(jiǎn)的模型，對(duì)模型分析中二次項(xiàng)影響不顯著的項(xiàng)進(jìn)行剔除，然后再進(jìn)行方差分析，得到響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的精簡(jiǎn)模型方差分析見(jiàn)表3。

從表3可以看出，AC、BC、A2、B2、C2、D2、E2對(duì)響應(yīng)值影響顯著，說(shuō)明乙醇濃度和料液比，溫度和料液比分別有交互作用，說(shuō)明乙醇濃度、溫度、料液比是總黃酮提取過(guò)程中的關(guān)鍵控制因素。失擬項(xiàng)p=0.075 2沒(méi)有顯著性意義，說(shuō)明數(shù)據(jù)中沒(méi)有異常點(diǎn)，不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)，模型適當(dāng)。該決定系數(shù)R2=0.985 6，表明該模型的擬合度好，建模成功。

表3 精簡(jiǎn)模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 ANOVA for the simple developed regression mode

根據(jù)精簡(jiǎn)模型可建立回歸方程為：

Y=5.11-0.014A-0.012B+0.018C+0.003125D-0.014E-0.048AC-0.038BC-0.41A2-0.39B2-0.38C2-0.40D2-0.41E2

2.2.3 響應(yīng)面分析

為了更直觀的表現(xiàn)兩個(gè)因素同時(shí)對(duì)總黃酮提取率的影響，可以令其他因素水平值為零，僅考慮這3個(gè)因素水平價(jià)值為零，即進(jìn)行降維分析，得到的二元二次方程可以繪出相應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高圖，由圖6可知，響應(yīng)面開(kāi)口向下，隨著每個(gè)因素的增大，響應(yīng)值增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小，該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。

2.2.4 模型確認(rèn)及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-expert編程得到的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度 75%，溫度69.95℃，料液比1∶29.8（g/mL），超聲功率350 W，超聲提取時(shí)間79.2 min，理論預(yù)測(cè)值總黃酮得率為4.68%。值得注意的是表2中的試驗(yàn)41～46的提取率較理論值（4.68%）大，原因是響應(yīng)面模型是大樣本統(tǒng)計(jì)值，而試驗(yàn)41～46得出的只是單一試驗(yàn)值，從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上來(lái)講不具代表性[14-15]。

參照理論上的最佳提取工藝條件，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整：乙醇濃度75%，溫度70℃，料液比1∶29 g/mL，超聲功率350 W，超聲提取時(shí)間79 min，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得試驗(yàn)結(jié)果平均值為4.71%。實(shí)測(cè)值與理論值極為接近。

圖6 各兩因素交互作用對(duì)桑葚酒渣總黃酮提取率影響的相應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of pairwise interactions various process conditions on extraction rate of flavonoids

3 結(jié)論

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert 7.0.1軟件，優(yōu)化后得到的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果較吻合。優(yōu)化后得到提取桑葚酒渣總黃酮的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度75%，提取溫度70℃，料液比1∶29（g/mL），超聲波功率350 W，提取時(shí)間79 min，在此條件下，桑葚酒渣總黃酮的提取率為4.71%。通過(guò)本試驗(yàn)可獲得桑葚酒渣總黃酮的優(yōu)化提取工藝條件，為桑葚酒渣中總黃酮超聲波輔助提取提供了理論依據(jù)。

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