GSTM1、GSTT1基因多態(tài)性與新疆維吾爾族慢性阻塞性肺疾病易感性的關系

王妨娥，凌 敏，白 杰，茍安栓，錢建輝，趙宗峰

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的特征為不完全可逆的氣流受限，氣流受限通常是與肺部異常炎癥反應的有害顆?；驓怏w有關［1］。Thakur et al［2］研究報告已經證實蛋白酶-抗蛋白酶和氧化酶-抗氧化酶的失平衡是導致COPD的主要因素。氧化酶-抗氧化酶失平衡導致的氧化應激可以損害氣道上皮組織和肺間質，增強炎癥反應，使促炎癥細胞因子基因上調，進而影響COPD的發(fā)生和發(fā)展。谷胱甘肽S轉移酶(Glutathione S-transferase，GST)作為其中的抗氧化酶在肺部起著保護作用，可以催化各種與還原型谷胱甘肽共軛的電化合物。因此，COPD的發(fā)展機制中可能不僅僅包括蛋白酶-抗蛋白酶失平衡，也有氧化酶-抗氧化酶失平衡的參與。很多研究［3－6］表明，COPD與GSTs的相關性存在民族和地域的差異。由于地理位置特殊，冬季漫長，氣候寒冷，COPD是新疆地區(qū)常見的呼吸系統(tǒng)疾病。凌敏 等［7］對新疆農村地區(qū)COPD危險因素調查后發(fā)現，維吾爾族和哈薩克族人群中COPD患病率較高。鑒于GSTM1、GSTT1基因多態(tài)性的分布在不同民族及地區(qū)間存在較大差異，且與新疆維吾爾族COPD的相關性研究未見相關報道，因此，該研究對GSTM1、GSTT1基因多態(tài)性與新疆維吾爾族COPD易感性的關系進行了研究，并與其他種族進行對比。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2011年8月～2013年8月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸科住院治療的新疆維吾爾族COPD患者80例(COPD組)，均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南》標準［1］，選擇年齡、性別匹配的本院健康體檢者80例為對照組，且肺功能符合以下指標:第一秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV1/FVC)＞70%，FEV1≥80%預計值，兩組均排除支氣管擴張、支氣管哮喘、肺部腫塊、結核性胸膜炎、胸廓畸形、肺間質纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病及其他感染性疾病、外傷及自身免疫性疾病。兩組年齡及性別均無顯著差異，具有可比性。兩組均為無民族間遺傳干擾(與其他民族人無通婚情況)、無血緣關系的連續(xù)兩代及以上長期居住于新疆的維吾爾族人群，所有受試者均簽署書面的志愿書，該研究經新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 全血基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)，GSTM1、GSTT1及白蛋白3對引物合成、Taq 酶、10 × Buffer、dNTP、ddH2O 均購于北京鼎國生物科技有限公司，DNA Marker購于BBI公司，DMSO購于美國Sigma公司，其他均為分子生物學常規(guī)試劑。

1.3 研究方法

1.3.1 標本采集 在清晨空腹時采集研究對象的靜脈血2 ml，EDTA抗凝，將抗凝管上下輕輕顛倒8～10次，使血液與抗凝劑充分混合，－20℃低溫保存。

1.3.2 基因組DNA提取 利用全血基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)，按照廠家提供的說明書方法提取全血基因組DNA。提取的DNA置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 多重PCR法檢測GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性 依據文獻合成GSTM1、GSTT1及白蛋白3對引物［6］，其中白蛋白為陽性內對照。3對引物序列如下，GSTM1上游引物:5'-GAACTCCCTGAAAAGC TAAAGC-3'，下游引物:5'-GTTGGGCTCAAATATAC GGTGG-3';GSTT1上游引物:5'-TTCCTTACTGGTCC TCACATCTC-3，下游引物:5'-TCACCGGATCATGG CCAGCA-3';白蛋白上游引物:5'-GCCCTCTGCTAA CAAGTCCTAC-3'，下游引物:5'-GCCCTAAAAAGA AAATCGCCAATC-3'。PCR 擴增反應體系(20 μl):10 × Tap Buffer 2 μl，10 mmol/L dNTP 混合物 2 μl，10 μmol/L 3 對上、下游引物各 0.5 μl，Taq 酶 5 U，50 ng/μl人基因組 DNA 1 μl，DMSO 1 μl，超純水補足20 μl;PCR反應條件:95℃預變性5 min;接著進行擴增，包括94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán);然后72℃延伸5 min，最后4℃保存。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并判別基因型。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料以±s表示;年齡、吸煙指數(用年吸煙包數表示:平均每天吸煙支數×吸煙年數/20)，均數比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗;各組間基因型和等位基因頻率的比較以及Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的吻合度采用χ2檢驗;多因素調整采用Logistic回歸分析，計算比值比(odds ratios，OR)和95%可信區(qū)間 (confidence intervals，CI)用來檢測 GSTM1、GSTT1與 COPD的相關性。所有統(tǒng)計均為雙側，顯著性檢驗水準取α=0.05。

2 結果

2.1 一般資料的比較 兩組資料在性別(男 ∶女比例為44∶36和41∶39)和年齡(平均年齡54.4±15.2和54.5±12.0)方面差異無統(tǒng)計學意義，兩組間吸煙指數差異均無統(tǒng)計學意義，兩組間FEV1預計值及FEV1/FVC差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 GSTM1、GSTT1基因純合缺失的檢測結果

所有樣本均能在350 bp處擴增出陽性內對照白蛋白目的條帶，480 bp處出現一條帶為GSTM1純合缺失型;215 bp處出現一條帶即為GSTT1純合缺失型;只出現一條白蛋白對照條帶為GSTM1、GSTT1同時為純合缺失型;在480 bp和215 bp出現兩條帶為GSTM1、GSTT1非純合缺失型，見圖1。

圖1 GSTM1、GSTT1基因多重PCR分析結果

2.3 GSTM1、GSTT1基因型在COPD組和對照組之間的分布差異 如表1所示新疆維吾爾族COPD組GSTM1純合缺失型基因型頻率(70.0%)高于對照組的頻率(51.3%)(P=0.015);GSTT1基因純合缺失型頻率在COPD組(40.0%)與對照組(21.3%)比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.01);GSTM1、GSTT1基因純合缺失型的基因頻率在COPD組與對照組的差異有統(tǒng)計學意義 (P=0.002)。以研究對象是否患COPD為因變量經Logistic回歸分析(協變量包括年齡、性別、吸煙史、GSTM1及GSTT1基因型)，經調整年齡、性別和吸煙史后，發(fā)現GSTM1基因純合缺失型則為COPD的危險因素 (OR=2.22，95%CI:1.16 ～4.25，P=0.016);GSTT1基因純合缺失型為COPD的危險因素(OR=2.47，95%CI:1.23 ～ 4.97，P=0.011)，GSTM1、GSTT1同時為純合缺失型則為COPD的危險因素(OR=4.67，95%CI:1.65～13.14，P=0.004)。

表1 GSTM1、GSTT1基因型在COPD組和對照組之間的分布差異［n=80，n(%)］

2.4 比較不同種族COPD組和對照組GSTM1、GSTT1基因型分布 由表2可見，GSTM1純合缺失型在哈薩克族、維吾爾族、北印度人和突尼斯人群中COPD組及對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);GSTT1純合缺失型、GSTM1、GSTT1同時純合缺失型在維吾爾族人群中差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而漢族人群中3種基因型在COPD組和對照組中差異均無統(tǒng)計學意義。

表2 兩組GSTM1、GSTT1基因型分布［n(%)］

3 討論

COPD 是多基因參與的復雜疾病，多個基因的多態(tài)性在COPD的易感性方面可能相互作用。氧化－抗氧化失衡是機體患COPD的一個主要發(fā)病機制，而抗氧化酶在其中起著重要作用。GSTs是一個超家族的酶系，參與許多親電子致癌物的解毒過程，在很多外源性化合物和藥物的解毒過程起著重要的作用［1］，從而起著保護肺組織的作用。

本研究首次分析了新疆維吾爾族人群GSTM1、GSTT1與 COPD易感性的關系。提示 GSTM1、GSTT1基因與新疆維吾爾族人群的COPD有顯著的相關性。對照組與COPD組對比結果提示GSTM1純合缺失型、GSTT1純合缺失型、GSTM1、GSTT1同時為純合缺失型時是COPD的危險因素，在除去COPD的主要危險因素后，兩組間的差異仍有統(tǒng)計學意義。因此，GSTM1純合缺失型、GSTT1純合缺失型是COPD的獨立危險因素。

本研究結果提示GSTM1純合缺失型、GSTT1純合缺失型可能和COPD易感性相關。Shuk et al［4］在北印度人群中研究表明:GSTM1純合缺失型基因為COPD的獨立危險因素。馬志明 等［8］對中國漢族人群研究發(fā)現GSTM1純合缺失基因型可能增加了長期大量吸煙人群對COPD的易感性，若同時伴有GSTT1的純合缺失型基因可進一步增加對COPD的易感性。Smolonska et al［9］在亞洲人群中采用 Meta分析時發(fā)現GSTM1基因純合缺失型為COPD的獨立危險因素，但進行分層分析后發(fā)現GSTM1基因純合缺失型可能不是COPD的獨立危險因素。此前，楊瑞紅 等［10］研究報道，GSTM1、GSTT1基因多態(tài)性與漢族人群COPD易感性沒有相關性，未發(fā)現兩個基因之間有明顯的協同作用。Lakhdar et al［5］沒有發(fā)現GSTM1基因多態(tài)性和突尼西亞人群COPD有獨立相關性。本課題組的前期研究［6］中也沒有發(fā)現GSTM1基因多態(tài)性與新疆哈薩克族人群的COPD有獨立相關性。這說明GSTM1、GSTT1基因在不同人群中的作用機制或對COPD的影響不同，可能與種族、地域等差異有關。這些研究結果提示，各地區(qū)各民族之間GSTM1、GSTT1基因分布確實存在差異。這可能是一些相關疾病在不同種族、不同區(qū)域間具有的不同發(fā)病率和臨床特點的主要原因。

有研究［10］顯示，攜帶GSTT1基因純合缺失型的人群比攜帶GSTT1非純合缺失型可能更容易導致具有遺傳毒性和肺部疾病，這可能與GSTT1在肺部沒有表達有關。近年來研究［11－13］證明COPD發(fā)生、發(fā)展過程中存在全身炎癥反應和全身性氧化應激反應。GSTT1可能通過參與拮抗全身性氧化應激的過程，起到一定的抗氧化作用。有研究［14］報道GSTM1基因純合缺失型及其他參與抗氧化過程基因的變異(例如GSTP1和環(huán)氧化物水解酶)是COPD的危險因素。因此，在今后的研究中，需擴大樣本量及增加其它參與氧化－抗氧化酶的研究(例如GSTP1或環(huán)氧化物水解酶等)，以尋找出效度較高的COPD易感性遺傳標記，以期為COPD防治提供新思路、新策略。

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