基于AFLP分子標(biāo)記探討福建近海竹莢魚群體遺傳多樣性

張麗艷，牛素芳，張 曼，王 軍＊

（1.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院 福建 廈門361102；2.福建海洋研究所 福建 廈門361012）

竹莢魚（TrachurusjaponicusTemminck et Schlegel）隸屬于鱸形目（Perciformes），鲹科（Carangidae），竹莢魚屬（Trachurus），為暖溫性中上層洄游性魚類，主要分布于西北太平洋的中國、日本和朝鮮半島沿海，是福建沿海的常見經(jīng)濟(jì)魚類［1］.

福建沿海竹莢魚的主要作業(yè)漁場(chǎng)為閩中—閩東漁場(chǎng)和閩南—臺(tái)灣淺灘漁場(chǎng).盧振彬等［2－3］通過對(duì)這兩個(gè)漁場(chǎng)不同生態(tài)類群漁業(yè)資源生產(chǎn)量的研究發(fā)現(xiàn)，兩漁場(chǎng)主要經(jīng)濟(jì)底層和近底層魚類實(shí)際年漁獲量均連續(xù)數(shù)年超過其最大可持續(xù)開發(fā)量，呈過度捕撈狀態(tài)，資源嚴(yán)重衰退，而中上層魚類資源已日漸取代底層和近底層魚類，成為兩漁場(chǎng)的重要開發(fā)對(duì)象.20世紀(jì)末，竹莢魚資源在閩南—臺(tái)灣淺灘漁場(chǎng)較為穩(wěn)定，但在閩東漁場(chǎng)已出現(xiàn)衰退現(xiàn)象［4］.21世紀(jì)初，宋普慶等［5］在對(duì)臺(tái)灣海峽游泳動(dòng)物調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)該海域游泳動(dòng)物資源衰退明顯，其中就包括竹莢魚.在這種情況下，急需開展竹莢魚野生資源現(xiàn)狀評(píng)估及群體遺傳特性研究，以便為科學(xué)合理的管理和利用竹莢魚野生資源提供依據(jù).目前，有學(xué)者依據(jù)竹莢魚的形態(tài)特征、性成熟和洄游分布狀況將東海竹莢魚劃分為不同的群體［6－9］，而臺(tái)灣海峽不同漁場(chǎng)之間的水文特征不同，可能導(dǎo)致竹莢魚群體在遺傳學(xué)上產(chǎn)生分化，本研究將從遺傳學(xué)的角度對(duì)其進(jìn)行判斷.

擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性（AFLP）技術(shù)是中性選擇的DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，具有用量少、檢測(cè)遺傳變異靈敏、擴(kuò)增效率高、多態(tài)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn).近年以來該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于海洋魚類的群體遺傳多樣性研究［10－13］、仔稚魚鑒定［14］、對(duì)野生和養(yǎng)殖群體的種質(zhì)資源評(píng)估［15］、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究［16］等諸多領(lǐng)域.本研究運(yùn)用AFLP技術(shù)對(duì)閩東漁場(chǎng)和閩南漁場(chǎng)的2個(gè)竹莢魚群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，研究結(jié)果將從遺傳學(xué)上揭示臺(tái)灣海峽竹莢魚的群體劃分，同時(shí)也為臺(tái)灣海峽竹莢魚遺傳資源現(xiàn)狀的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)與合理開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材 料

于2009年3—4月，采集福建省寧德霞浦近海和廈門近海2個(gè)竹莢魚群體（閩東群體和閩南群體）樣品，樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和測(cè)量，其中體長分別為168.6～246.3mm、178.2～251.0mm，叉長范圍分別為176.4～220.8mm、196.1～246.4mm.閩東、閩南群體各隨機(jī)挑選30尾，取背部肌肉保存于95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇中.

1.2 基因組DNA提取和AFLP圖譜構(gòu)建

采用酚－三氯甲烷方法提取基因組DNA，將乙醇沉淀后的基因組DNA溶解于100μL蒸餾水中，4℃保存?zhèn)溆?參照Vos等［17］的方法構(gòu)建AFLP圖譜.利用內(nèi)切酶EcoR I和MseI進(jìn)行雙酶切；然后與EcoR I接頭和MseI接頭進(jìn)行接頭；預(yù)擴(kuò)增引物的3′末端加1個(gè)選擇性堿基，其序列分別為EcoR I＋A（5′－GACTGCGTACCAATTC＋A 3′）和MseI＋C （5′－GATGAGTCCTGAGTAA＋C 3′）；將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物進(jìn)行10倍稀釋用于選擇性擴(kuò)增，選擇性擴(kuò)增引物的3′末端加3個(gè)選擇性堿基（表1）.將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行60W恒功率高壓電泳.電泳結(jié)束后，用10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乙酸固定、銀染和顯影.選取擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的8對(duì)引物組合：E1／M5、E1／M1、E5／M3、E2／M2、E5／M5、E1／M2、E1／M4、E2／M3進(jìn)行AFLP數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

AFLP為顯性標(biāo)記，對(duì)電泳圖譜中同一位置上清晰的AFLP條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有條帶記為1，視為顯性表型，無條帶記為0，視為隱形表型，得出0和1原始數(shù)據(jù)矩陣.利用POPGENE 1.31軟件統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)總數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)和每個(gè)引物組合的多態(tài)位點(diǎn)比例，計(jì)算顯性基因型頻率、Shannon多樣性指數(shù)、Nei遺傳多樣性指數(shù)、遺傳分化系數(shù)（Gst）、遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離；利用SPSS 13.0中的t檢驗(yàn)對(duì)Nei遺傳多樣性指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)；利用Phyltools 1.32軟件計(jì)算獲得個(gè)體間遺傳距離矩陣，利用軟件MEGA 5.0構(gòu)建基于個(gè)體間遺傳距離的NJ聚類樹；利用 Arlequin 3.1進(jìn)行分子生物學(xué)方差分析（AMOVA）和位點(diǎn)差異數(shù)分析.遺傳學(xué)參數(shù)計(jì)算主要參考文獻(xiàn)［13］.

2 結(jié) 果

利用8對(duì)選擇性引物，在60尾竹莢魚中共擴(kuò)增出433條清晰的條帶（100～1 000bp，不清晰的條帶不納入統(tǒng)計(jì)）.其中，多態(tài)性條帶為286條，多態(tài)位點(diǎn)比例為66.05%.每個(gè)引物組合產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶數(shù)范圍為40～69條，擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶范圍為24～54條，多態(tài)檢出率范圍為60.00%～78.26%（表2）.

表1 選擇性擴(kuò)增引物Tab.1 Selective amplification primers and their sequences used in AFLP analysis

表2 各引物組合的擴(kuò)增結(jié)果Tab.2 Number of bands generated by primer combinations

8對(duì)選擇性引物在閩東和閩南2個(gè)群體的433條條帶中，并未發(fā)現(xiàn)群體間的特異性條帶.閩東和閩南群體平均多態(tài)位點(diǎn)比例分別為63.28%和61.89%，Nei遺傳多樣性指數(shù)分別為0.171 8和0.172 2，Shannon多樣性指數(shù)分別為0.267 3和0.267 3（表2、表3）.綜合比較所有遺傳多樣性參數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，閩東和閩南2個(gè)竹莢魚群體的遺傳多樣性水平基本一致，兩者之間的差異并不顯著（Nei遺傳多樣性指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)的p值分別為0.880和0.938）.

表3 竹莢魚2個(gè)群體的遺傳學(xué)參數(shù)Tab.3 Parameters of genetic diversity for two populations of T.japonicus

2個(gè)群體間擴(kuò)增位點(diǎn)遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離分別為0.984 2和0.015 9；根據(jù)Gst、AMOVA 分析估算的竹莢魚2個(gè)群體的遺傳變異分別有95.57%、93.99%存在于群體內(nèi)，4.43%、6.01%存在于群體間（表4）；2個(gè)群體間Nm高達(dá)10.796 9（表3）.分析表明，竹莢魚2個(gè)群體間未發(fā)現(xiàn)顯著的遺傳結(jié)構(gòu)，不存在明顯遺傳分化.

表4 竹莢魚遺傳結(jié)構(gòu)的AMOVA分析Tab.4 Analysis of molecular variance（AMOVA）of genetic structure for T.japonicus

將433條擴(kuò)增條帶的顯性基因型頻率以10%為單位劃分區(qū)間，0和1分別設(shè)為一個(gè)單獨(dú)的區(qū)間，統(tǒng)計(jì)顯性基因型頻率位于各區(qū)間內(nèi)的位點(diǎn)數(shù)（圖1）.結(jié)果顯示，在1%～9%、80%～89%和關(guān)鍵點(diǎn)1的基因型頻率呈現(xiàn)峰值，2個(gè)群體的顯性基因型頻率分布基本一致，說明2個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)相似.利用Arlequin軟件統(tǒng)計(jì)個(gè)體間位點(diǎn)差異數(shù)頻率分布（mismatch distribution），單個(gè)群體和所有個(gè)體位點(diǎn)差異數(shù)分布見圖2.圖中2個(gè)群體位點(diǎn)差異數(shù)分布圖都呈單峰型，峰值差異位點(diǎn)數(shù)雖有所偏移但相差很小，說明個(gè)體間遺傳距離頻率分布基本相同，2個(gè)群體遺傳結(jié)構(gòu)非常相近.

圖2 竹莢魚AFLP數(shù)據(jù)觀測(cè)位點(diǎn)差異數(shù)分布圖Fig.2 The observed pairwise differences of the AFLP data of T.japonicas

為進(jìn)一步分析2個(gè)竹莢魚群體間遺傳分化程度，利用MEGA 5.0軟件對(duì)60尾竹莢魚個(gè)體構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹（圖3）.系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)較簡單，未檢測(cè)到與采樣地點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的分支，不存在明顯的譜系結(jié)構(gòu)，同樣說明2個(gè)群體間的遺傳分化不明顯.

圖1 擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)在不同顯性基因頻率區(qū)間內(nèi)的分布Fig.1 Distributions of amplified loci in different frequency intervals

圖3 竹莢魚60個(gè)個(gè)體的NJ聚類樹Fig.3 NJ tree of 60individuals of T.japonicas

3 討 論

3.1 群體遺傳多樣性水平

物種的遺傳多樣性是其進(jìn)化潛能的保證，是生存、發(fā)展和進(jìn)化的前提，同樣也是形成生物多樣性的基礎(chǔ).物種遺傳多樣性愈高，其適應(yīng)周圍環(huán)境的能力愈強(qiáng)；反之，則易受到環(huán)境變化的影響，尤其是過度捕撈等人為因素造成的物種遺傳多樣性的降低更應(yīng)引起重視.本研究利用8對(duì)引物對(duì)福建沿海竹莢魚資源的遺傳多樣性進(jìn)行了AFLP分析，結(jié)果呈現(xiàn)出豐富的多態(tài)性和較高的靈敏度，表明AFLP技術(shù)適用于竹莢魚的群體遺傳學(xué)分析.

比較2個(gè)竹莢魚群體的多態(tài)位點(diǎn)比例、Nei遺傳多樣性指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)，閩東和閩南群體的遺傳多樣性水平基本一致，兩者之間并無差異顯著，都具有較高的遺傳多樣性.比較以往魚類AFLP研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，福建近海竹莢魚的多態(tài)位點(diǎn)比例（61.89%～63.28%）明顯高于我國沿海多種經(jīng)濟(jì)魚類（表5）；與同海域的藍(lán)圓鲹（Decapterusmaruadsi）（58.97%～62.70%）［13］相近.可見，福建近海竹莢魚群體的多樣性仍處于較高水平，具有較高的進(jìn)化潛力.

表5 我國沿海經(jīng)濟(jì)魚類AFLP多態(tài)位點(diǎn)比例比較Tab.5 Comparison of percentage of AFLP polymorphism of economic fishes in China′s coastal waters

福建近海竹莢魚資源仍保持相當(dāng)豐富的遺傳變異水平的原因是：1）竹莢魚生境范圍較廣，使其面臨的自然選擇壓力相對(duì)較小，可以積累較多的遺傳變異；2）Frankhan［23］認(rèn)為動(dòng)物遺傳多樣性與個(gè)體大小呈負(fù)相關(guān)，個(gè)體越小繁殖周期越短則遺傳變異越大.竹莢魚成魚體長一般為200～250mm［1］，性成熟年齡為Ⅰ齡，年齡結(jié)構(gòu)為0～Ⅳ齡［7］.具有生命周期短，生長速度快，性成熟早，生殖魚群中補(bǔ)充群體數(shù)量大于剩余群體的特點(diǎn)［6］，可影響其有效群體的數(shù)量，使遺傳多樣性偏高；3）第四紀(jì)以來的全球性溫度大幅度升降導(dǎo)致了物種遺傳多樣性的丟失，處于物種分布區(qū)南北兩邊緣的群體遺傳多樣性損失最高［24］.竹莢魚的分布范圍從中國南海跨度到日本海域，福建近海處于其分布海域的中部位置，這使得該海域竹莢魚在冰期氣候波動(dòng)中受到的影響相對(duì)較小，保留了較高的遺傳多樣性.

3.2 群體遺傳分化分析

AMOVA分析和NJ聚類樹均未檢測(cè)到相對(duì)應(yīng)的地理分支或者地理群，且Gst值偏小.這些結(jié)果都表明福建近海的竹莢魚群體間遺傳分化較小，遺傳變異主要存在于群體內(nèi)，群體間無明顯的遺傳分化.位點(diǎn)差異數(shù)分布和顯性基因頻率分布圖顯示，2個(gè)群體遺傳結(jié)構(gòu)相似，沒有形成各自獨(dú)立的遺傳結(jié)構(gòu).已有研究結(jié)果表明，許多海洋魚類如日本鳀（Engraulisjaponicus）［25］、帶魚（Trichiurushaumela）［26］、銀鯧［12］、藍(lán)圓鲹［13］等在東海海域的連續(xù)分布區(qū)內(nèi)都不存在顯著遺傳差異.在更新世冰期，作為西太平洋幾個(gè)廣闊的大陸架之一，東海陸架約有85萬hm2的面積因?yàn)楹Ｆ矫娴南陆底優(yōu)殛懙兀?0］.末次冰期后，伴隨海平面上升，該海域 的 白 姑 魚 （Nibeaalbiflora）［11］、梭 魚 （Chelon haematocheilus）［27］等由其避難所發(fā)生重新殖化事件，之后又發(fā)生近期擴(kuò)張重新進(jìn)入東海大陸架.福建近海竹莢魚棲息地?cái)U(kuò)張發(fā)生的時(shí)間比較晚，群體由于缺乏足夠的時(shí)間在遷移和漂變之間取得平衡而造成這些物種群體間均無明顯遺傳分化.這也是福建近海竹莢魚遺傳同質(zhì)性高的一個(gè)原因.Song等［9］利用線粒體控制區(qū)基因片段對(duì)中日沿海9個(gè)群體的竹莢魚研究發(fā)現(xiàn)，竹莢魚群體可能經(jīng)歷過近期群體擴(kuò)張事件，群體間無明顯遺傳分化，與本研究結(jié)果相同.

環(huán)境動(dòng)力和擴(kuò)散特征也通常被認(rèn)為是決定群體結(jié)構(gòu)的重要因素之一.海洋大環(huán)境中不存在明顯的有效地理隔離，且洋流對(duì)海洋生物卵、幼體和成魚具有較強(qiáng)的輸送作用，這些因素使得群體間分化程度很低，不存在顯著的遺傳結(jié)構(gòu)［28］.竹莢魚產(chǎn)卵期為11月至翌年4月［6］，屬浮性卵，受精卵在水溫20～22℃時(shí)，約50h孵出仔魚［1］.此外，竹莢魚具有明顯的季節(jié)洄游，其產(chǎn)卵場(chǎng)和越冬場(chǎng)在東海中南部，而索餌場(chǎng)在東海中北部和黃海部分海域［1］.這些生活史特征表明竹莢魚的卵、幼魚和成魚具有較強(qiáng)的擴(kuò)散能力.而福建近海交匯的黑潮、臺(tái)灣暖流和臺(tái)灣海峽北上海流則有利于該海域生物卵和幼體的擴(kuò)散.在夏季，有部分閩南—臺(tái)灣淺灘漁場(chǎng)的竹莢魚幼魚階段魚群到達(dá)閩中、閩東沿海［6］，成為閩東漁場(chǎng)竹莢魚的補(bǔ)充群體，這可能就是借助臺(tái)灣暖流和臺(tái)灣海峽北上海流完成的.群體間Nm用來表示群體間的基因交流程度，當(dāng)Nm＞4，則表明群體間是一隨機(jī)交配的群體［29］.本研究的2個(gè)竹莢魚群體間基因流明顯大于4（10.796 9），表明閩東、閩南群體間基因交流頻繁，不存在交配障礙.據(jù)此認(rèn)為，竹莢魚較強(qiáng)的擴(kuò)散能力和福建近海的洋流也可能造成福建近海竹莢魚缺乏系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu).

在漁業(yè)管理應(yīng)用中應(yīng)持謹(jǐn)慎態(tài)度.雖然本研究結(jié)果從遺傳學(xué)角度上表明竹莢魚仍具有較高的遺傳多樣性，但過度捕撈可能會(huì)造成竹莢魚的低齡化，在幼魚被大量的捕撈的情況下，整個(gè)竹莢魚的資源量長時(shí)間得不到持續(xù)有效的補(bǔ)充，最終可能會(huì)導(dǎo)致資源的進(jìn)一步衰退.

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