胃癌組織中跨膜絲氨酸蛋白酶4的表達及其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

孫思柏，吳繼鋒，2

胃癌的發(fā)病機制尚不明確，其病死率居高不下的主要原因是胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［1］。跨膜絲氨酸蛋白酶 4(TMPRSS4)是 Wallrapp et al［2］在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)，并進一步發(fā)現(xiàn)其表達與胰腺癌細胞株的轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)，從而猜測其與腫瘤的侵襲有關(guān)。上 皮 間 質(zhì) 轉(zhuǎn) 化 (epithelial－mesenchymal transtion，EMT)是指上皮細胞失去細胞間的黏附力、基底部的極性以及特異性蛋白的表達從而使其獲得運動性、梭形細胞樣改變和表達間質(zhì)細胞特異性蛋白的過程，這是細胞表型的改變而并非是細胞類型的改變［3］。Jung et al［4］發(fā)現(xiàn)高表達的 TMPRSS4 可以誘導E－鈣黏蛋白(E－cadherin)介導的細胞間的黏附力缺失，導致EMT的發(fā)生，其中包括形態(tài)學的改變、肌動蛋白的重組和間質(zhì)細胞特異性蛋白表達的上調(diào)，從而增加腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。該研究主要通過免疫組織化學法檢測胃癌組織中TMPRSS4的表達，分析其與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性，并探討其對判斷患者預后的意義;進一步探討TMPRSS4的表達與EMT相關(guān)蛋白 E－cadherin、波形蛋白(Vimentin)之間的關(guān)系。從而推測TMPRSS4可能通過誘導EMT從而發(fā)生腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 收集2003年1月～2005年12月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院普外科胃癌手術(shù)切除標本100例，其中男64例，女36例，年齡29～76(60.32±11.65)歲;分化程度:高分化6例，中分化38例，低分化56例;腫瘤大小分級:?＜5 cm者45例，?≥5 cm者55例;浸潤深度分級:未浸潤至漿膜者15例，浸潤至漿膜者85例。患者均為初治病例，術(shù)前未經(jīng)任何化療及放療，術(shù)后均經(jīng)病理醫(yī)師證實為胃癌。取對應(yīng)癌旁組織進行自身對照，腫瘤組織及癌旁組織經(jīng)4%福爾馬林浸泡固定并經(jīng)石蠟包埋，連續(xù)3 μm切片。所有患者臨床資料完整，并對全部患者進行隨訪，隨訪截止日期為2010年12月。

1.1.2 主要試劑 兔抗人TMPRSS4(11283－1－AP)一抗購于美國Protein Tech公司;鼠抗人Vimentin(ZM－0260)一抗、鼠抗人 E－cadherin(ZM－0092)一抗、二抗試劑盒、DAB顯色液均購于北京中杉金橋公司;常規(guī)免疫組化試劑、冰箱等由安徽醫(yī)科大學病理實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 對所有切片進行免疫組化染色，方法采用免疫組化SABC法，所有步驟按照說明書進行。石蠟切片經(jīng)過脫蠟水化后，TMPRSS4及E－cadherin一抗采用抗原高壓熱修復，Vimentin一抗采用抗原微波熱修復，過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉后滴加一抗。其中Vimentin及E－cadherin稀釋濃度均為1∶100，TMPRSS4的稀釋濃度為1∶50。然后放入冰箱4℃過夜，滴加二抗，滴加abc復合物，DAB顯色，蘇木精復染。用陽性組織切片作為陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 結(jié)果判定 TMPRSS4蛋白在胃癌組織中主要定位于細胞膜上，少量定位于胞質(zhì)內(nèi)，E－cadherin蛋白在胃癌組織中主要定位于細胞膜和(或)細胞質(zhì)內(nèi)。以上兩種蛋白皆以細胞質(zhì)和(或)細胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕褐色為陽性;Vimentin以細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕色為陽性。采用半定量積分法判斷陽性結(jié)果［5］，陽性細胞染色強度評分如下:無染色或基本無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;陽性細胞所占比例評分:每例隨機選擇5個高倍鏡(×400)視野下觀確定陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞所占胃腺上皮細胞的百分率，取平均數(shù)，其中細胞陽性率＜10%為0分，10% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為3分。兩者相乘，乘積≤3分記為陰性，＞3分記為陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。采用χ2檢驗分析TMPRSS4的表達與臨床病理特征之間的關(guān)系，采用Spearman等級相關(guān)分析來檢驗TMPRSS4與Vimentin及 E－cadherin之間的相關(guān)性，單因素生存分析采用Log－Rank檢驗并用Kaplan－Meier法計算生存率。

2 結(jié)果

2.1 TMPRSS4、Vimentin 及 E-cadherin 在胃癌組織中的表達 100例胃癌組織及癌旁正常組織免疫組化結(jié)果顯示:TMPRSS4和E－cadherin蛋白以細胞質(zhì)和(或)細胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕褐色為陽性，其中E－cadherin在癌旁組織中的染色程度深，而在癌組織中染色程度較弱。Vimentin以細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕色為陽性，見圖1。100例胃癌組織中 TMPRSS4、Vimentin 及 E－cadherin 的陽性率分別為47%、37%、45%，其對應(yīng)癌旁組織中的陽性率分別為9%、4%、30%。腫瘤組織中的表達與癌旁組織差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

圖1 胃癌及癌旁正常組織中TMPRSS4、Vimentin、E-cadherin蛋白的表達 SABC×200

表1 TMPRSS4、Vimentin、E-cadherin 在胃癌及癌旁組織中的陽性表達［n(%)］

2.2 TMPRSS4的表達與臨床病理特征之間的關(guān)系 TMPRSS4的表達與胃癌患者的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05)，而與患者的年齡、性別、腫瘤組織的大小、分化程度及浸潤深度無顯著相關(guān)(P ＞0.05)，見表2。

2.3 TMPRSS4的表達與 Vimentin及E-cadherin之間的關(guān)系 100例胃癌組織中Vimentin及E－cadherin之間存在密切相關(guān)性。其中TMPRSS4與Vimentin呈正相關(guān)性(rs=0.233，P=0.020);TMPRSS4與 E－cadherin呈負相關(guān)性(rs= －0.207，P=0.038)，見表 3。

2.4 TMPRSS4的表達與胃癌患者預后的關(guān)系TMPRSS4陽性患者術(shù)后5年生存率明顯低于陰性患者(χ2=15.175，P ＜0.05)，見圖2。

表2 TMPRSS4的表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表3 胃癌組織中TMPRSS4的表達與Vimentin、E-cadherin之間的關(guān)系

圖2 TMPRSS4陽性組與陰性組胃癌患者的K-M生存曲線

3 討論

腫瘤細胞的侵襲性在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。腫瘤細胞的侵襲是一種復雜的多相過程，包含3個步驟:細胞外基質(zhì)黏附力的改變;降解細胞外基質(zhì)蛋白，使腫瘤細胞從原發(fā)灶中遷移出來;腫瘤細胞直接從腫塊的縫隙中遷移［6］。蛋白水解酶的失調(diào)是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的一個標志性事件，這其中絲氨酸蛋白酶是主要的蛋白水解酶之一，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用［7］。研究［8］表明蛋白水解酶可以促進基底細胞膜和ECM的降解以及組織的重組。所以水解酶可能涉及腫瘤發(fā)生發(fā)展的所有階段，包括腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管發(fā)生和患者的存活時間。

絲氨酸蛋白酶家族的大部分成員一種是分泌型蛋白酶，即蛋白合成后就迅速轉(zhuǎn)移至胞外;一種在胞質(zhì)細胞器內(nèi)貯存等待調(diào)節(jié)信號的刺激分泌釋放。最近，Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶(typeⅡ transmembrane serine proteases，TTSP)被認定為絲氨酸家族的新亞型，其成員都擁有蛋白水解區(qū)域、跨膜區(qū)域、短的胞質(zhì)區(qū)域和可變長度的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)區(qū)域［9］。Wallrapp et al［2］通過對比胰腺癌和正常胰腺組織發(fā)現(xiàn)TMPRSS4這一新的TTSP家族的成員，通過研究發(fā)現(xiàn) TMPRSS4在胰腺癌中的表達遠高于正常的胰腺組織，并且與胰腺癌細胞株轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)，猜測其與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。但是目前TMPRSS4在腫瘤中的生物學功能尚不明確。近期研究［2，4，10－12］顯示TMPRSS4可在胰腺癌、甲狀腺癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和胃癌中表達。本實驗通過免疫組化發(fā)現(xiàn)其在胃癌組織中的表達明顯高于其對應(yīng)癌旁組織。Nguyen et al［11］通過實時定量 RT－PCR、免疫組織化學法和免疫印跡法來檢測肺非小細胞癌(non small cell lung cancer，NSCLC)和正常肺組織以及NSCLC細胞株 COS－1的 mRNA和蛋白表達水平。發(fā)現(xiàn)TMPRSS4在NSCLC中的mRNA和蛋白表達顯著高于正常肺組織，但是在COS－1中TMPRSS4的mRNA呈高水平表達卻沒有檢測到對應(yīng)的蛋白高表達，而經(jīng)過缺氧環(huán)境培養(yǎng)的COS－1細胞株卻能增加TMPRSS4的蛋白表達。說明肺癌組織中的缺氧環(huán)境可能增強TMPRSS4的蛋白表達，而其mRNA的高水平并不一定能代表其蛋白也高表達。Luo et al［12］研究發(fā)現(xiàn)TMPRSS4在胃癌中的表達與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，其在胃癌組織中的表達明顯高于其對應(yīng)癌旁組織，說明TMPRSS4與胃癌癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其陽性患者的五年生存率低于其陰性患者。與本實驗的結(jié)論相同。此外Luo et al［12］還發(fā)現(xiàn)TMPRSS4的表達與胃癌患者腫塊大小和浸潤深度有關(guān)，并通過多元統(tǒng)計分析認為TMPRSS4可以獨立作為胃癌預后的判斷指標。本實驗由于標本數(shù)量有限，未發(fā)現(xiàn)上述結(jié)論。

EMT是指上皮細胞受到各種刺激，失去了細胞極性，其表型向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化的復雜過程［13］。EMT的研究重點在于其在惡性腫瘤演進過程中的作用。目前認為EMT的發(fā)生可以促進腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。在EMT的過程中，細胞的表型發(fā)生變化，與表型相關(guān)分子量也會隨之改變。其中最主要的改變是E－cadherin的減少甚至丟失，這不僅被認為是癌細胞失去上皮表型的標志，也被認為是促進腫瘤轉(zhuǎn)移的最主要表現(xiàn)。而主要由角蛋白構(gòu)成的細胞骨架逐步轉(zhuǎn)變?yōu)橛蒝imentin為主構(gòu)成的細胞骨架，此外還常常出現(xiàn)間質(zhì)表型分子數(shù)量的增加，如N－cadherin、α－平滑肌動蛋白(smooth muscle actin，SMA)等［14］。TMPRSS4的生物學功能和在腫瘤中的潛在機制還沒探究清楚，但是其在上皮細胞來源的腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用已經(jīng)得到肯定。目前關(guān)于其與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究集中于其在EMT中的發(fā)生機制上。Jung et al［4］首次在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)高表達的TMPRSS4可以誘導E－cadherin蛋白表達的缺失從而導致EMT的發(fā)生，其中包括形態(tài)學的改變和肌鈣蛋白的重組。Kim et al［15］發(fā)現(xiàn)TMPRSS4可以經(jīng)由整合蛋白α5的上調(diào)來激活黏著斑激酶(focal adhesin kinase，F(xiàn)AK)信號途徑和細胞外 信 號 調(diào) 節(jié) 激 酶 (extracellular signal－regulated kinase，ERK)導致EMT和腫瘤侵襲的發(fā)生。本實驗也表明TMPRSS4在胃癌中的表達與E－cadherin的表達呈負相關(guān)，而與Vimentin的表達呈正相關(guān)。該結(jié)果提示TMPRSS4可能通過誘導EMT的發(fā)生引起腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，從而影響患者的生存時間。

綜上所述，TMPRSS4可在胃癌組織中表達并與EMT之間存在密切關(guān)聯(lián)，TMPRSS4可能通過誘導EMT促進胃癌組織的侵襲和轉(zhuǎn)移。聯(lián)合檢測3種蛋白可以幫助判斷胃癌的惡性程度及預后。但是關(guān)于TMPRSS4誘導EMT的發(fā)生機制尚不清楚，為此仍需進一步確定其相關(guān)分子機制從而提高胃癌的治療效果，改善預后。

［1］Yang L.Incidence and mortality of gastric cancer in China［J］.World J Gastroenterol，2006，12(1):17 － 20.

［2］Wallrapp C，Hahnel S，Mttler－Pillasch F，et al.A novel trans－membrane sarine protease(TMPRSS3)overexpressed in pancreatic cancer［J］.Cancer Res，2000，60(10):2602 －6.

［3］Tsuji T，Ibaragi S，Hu G F.Epithelial－mesenchymal transition and cell cooperativity in metastasis［J］.Cancer Res，2009，69(18):7135－9.

［4］Jung H，Lee K P，Park S J，et al.TMPRSS4 promotes invasion，migration and metastasis of human tumor cells by facilitating an epithelial－mesenchymal transition［J］.Oncogene，2008，27(18):2635－47.

［5］許良中，楊文濤.免疫組織化學反應(yīng)結(jié)果的判斷標準［J］.中國癌癥雜志，1996，6(2):229 －31.

［6］Stetler－stevenson W G.The role of matrix metalloproteinases in tumor invasion，metastasis，and angiogenesis［J］.Surg Oncol Clin N Am，2001，10(2):383－92.

［7］Duffy M J.Proteases as prognostic markers in cancer［J］.Clin Cancer Res，1996，2(16):613 －8.

［8］List K，Bugge T H，Szabo R.Matriptase:potent proteolysis on the cell surface［J］.Mol Med，2006，12(1 －3):1 －7.

［9］Hooper J D，Clements J A，Quigley J P，et al.Type II transmembrane serine proteases.Insights into an emerging class of cell surface proteolytic enzymes［J］.J Biol Chem，2001，276(2):857 －60.

［10］Kebebew E，Peng M，Reiff E，et al.ECM1 and TMPRSS4 are diagnostic markers of malignant thyroid neoplasms and improve the accuracy of fine needle aspiration biopsy ［J］.Ann Surg，2005，242(3):353－61.

［11］Nguyen T H，Weber W，Havari E，et al.Expression of TMPRSS4 in non－small cell lung cancer and its modulation by hypoxia［J］.Int J Oncol，2012，41(3):829 －38.

［12］Luo Z Y，Wang Y Y，Zhao Z S，et al.The expression of TMPRSS4 and Erk1 correlates with metastasis and poor prognosis in Chinese patients with gastric cancer［J］.PLoS One，2013，8(7):e70311.

［13］Thiery J P，Acloque H，Huang R Y，et al.Epithelial－mesenchymal transition in development and disease［J］.Cell，2009，139(5):871－90.

［14］Kalluri R，Weinberg R A.The basics of Epithelial－mesenchymal transition ［J］.J Clin Invest，2009，119(6):1420 － 8.

［15］Kim S，Kang H Y，Nam E H，et al.TMPRSS4 induces invasion and epithelial－mesenchymal transition through upregulation of integrin a5 and its signaling pathways［J］.Carcinogenesis，2010，31(4):597－606.