膀胱尿路上皮癌中MIF與VEGF的表達(dá)及其臨床意義

張 珺，吳 奎，肖 峻，陳遠(yuǎn)哲，熊 宇

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(microphage migration inhibitor factor，MIF)主要由活化T淋巴細(xì)胞分泌，早期發(fā)現(xiàn)與炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞因子。近年來研究［1］顯示，MIF在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用，具體表現(xiàn)在促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化、腫瘤血管的形成、腫瘤侵襲能力，甚至抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡等。實(shí)體腫瘤血管的形成是其生長和遷徙的基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是新生血管形成過程中最重要的刺激因子之一，它能夠通過誘導(dǎo)腫瘤血管的形成促進(jìn)腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。研究［2］顯示VEGF與膀胱移形細(xì)胞癌的侵襲能力有關(guān)，并可能作為判斷預(yù)后的指標(biāo)。該研究主要探討MIF與VEGF在膀胱尿路上皮癌(bladder transitional cell carcinoma，BTCC)組織中的表達(dá)及其臨床意義，并分析二者之間可能存在的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集2011年2月～2012年6月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院泌尿外科接受手術(shù)治療的BTCC患者75例，男45例，女30例，年齡16～81(58.30±22.61)歲。根據(jù)國際抗癌協(xié)會(huì)2009年第7版TNM病理臨床分期和2004年WHO病理分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級和分期，其中表淺性(Ta～T1期)50例，浸潤性(T2～T4期)25例。低度惡性傾向尿路上皮乳頭狀瘤28例，低分級BTCC 26例，高分級BTCC 21例。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者54例。患者均行手術(shù)治療，其中，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)47例，膀胱部分切除術(shù)24例，全膀胱術(shù)4例。另取12例正常膀胱黏膜組織作為對照組。標(biāo)本取材后分兩部分，一部分立即放入RNA組織保護(hù)液中，4℃過夜，－80℃保存用于RT-qPCR;另一部分經(jīng)過10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片后用于免疫組化染色。

1.2 主要試劑 抗人MIF單克隆抗體購自北京博奧森生物制藥公司;抗人VEGF、CD31單克隆抗體、S-P試劑盒(含二抗、DAB顯色劑)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;熒光定量PCR檢測系統(tǒng)購自德國 Biometra;TRIzol Reagent、RNase抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶(含 buffer)、dNTP、SYBR Green qPCR mix購自大連寶生物工程公司;引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測mRNA表達(dá) 按照TRIzol說明書對所取組織進(jìn)行RNA提取，并經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定A260/A280比值定量在1.8～2.0之間，以其為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;MIF正向引物:5'-CCATGCCTATGTTCATCGTG-3'，反向引物為5'-GAACAGCGGTGCAGGTAAGTG-3';VEGF正向引物為:5'-ACGTCTGCGGATCTTGGACA-3'，反向引物為:5'-GGGCTGCTGCAATGATGAAG-3';所選內(nèi)參為 β-actin，正向引物為:5'-CCAAGGCCAAC-CGCGAGAAGATGAC-3'，反向引物為:5'-AGGGTACATGGTGGTGGCGCCAGAC-3';RT-qPCR總反應(yīng)體系為 25 μl，SYBR Green mix 12.5 μl，正反向引物各1 μl，ddH2O 8 μl，cDNA 2.5 μl，進(jìn)行擴(kuò)增并采用2－ΔCT計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。反應(yīng)條件:94℃ 3 min，1 個(gè)循環(huán);94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.4 免疫組化染色 石蠟包埋組織4 μm連續(xù)切片，常規(guī)37℃烘烤30 min，后二甲苯、乙醇脫蠟、水化，3%過氧化氫溶液浸泡10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。VEGF采用高溫抗原修復(fù)20 min，MIF、CD31采用微波枸櫞酸鹽抗原修復(fù)，緩慢復(fù)溫至室溫水洗后PBS清洗3次，每次3 min，正常血清封閉15 min后加一抗(VEGF濃度為1∶400;MIF濃度為1∶400;CD31濃度為1∶500)，4℃過夜，PBS清洗3次，每次3 min。加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育15 min，PBS洗滌3次，每次3 min;加DAB顯色劑，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照組。

1.5 結(jié)果判定 RT-qPCR完成后采用2－ΔCT計(jì)算mRNA相對表達(dá)量，并計(jì)算平均表達(dá)量。MIF和VEGF陽性型號均位于胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)、部分細(xì)胞膜、細(xì)胞核呈棕黃色為陽性細(xì)胞，每張切片在×400高倍視野下隨機(jī)選擇4個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。“－”為不表達(dá)或者＜30%細(xì)胞表達(dá)，“+”陽性細(xì)胞數(shù)為30% ～50%，“”陽性細(xì)胞數(shù)為50% ～70%，“”陽性細(xì)胞數(shù)為＞70%。微血管密度(microvascular density，MVD)計(jì)數(shù):先在低倍鏡(×100)下選擇出微血管最密集的區(qū)域，然后于高倍鏡(×400)下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的微血管數(shù)目，取平均值作為該病例的MVD值。所有切片均經(jīng)3位病理醫(yī)師在不清楚患者任何臨床資料的情況下獨(dú)立完成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，各指標(biāo)與患者臨床病理資料的關(guān)系采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，各指標(biāo)間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 MIF、VEGF mRNA的表達(dá)差異 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MIF的PCR產(chǎn)物長度為368 bp，VEGF的PCR產(chǎn)物長度為380 bp，溶解溫度較均一，峰形也較銳利。分析mRNA表達(dá)情況，其中膀胱癌組織中MIF、VEGF mRNA的平均相對表達(dá)量與正常黏膜組織比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002，P=0.008);浸潤性癌組織中mRNA的表達(dá)量與表淺性癌組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045，P=0.018)，見表1。

表1 MIF、VEGF mRNA的表達(dá)(±s)

表1 MIF、VEGF mRNA的表達(dá)(±s)

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2.2 MIF在BTCC組織中的表達(dá) MIF陽性信號主要位于癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)(圖1)，75例BTCC組織中，53例呈陽性，MIF陽性率為70.6%。12例正常膀胱組織中MIF陽性1例，陽性率為8.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中MIF表達(dá)水平(20/21，95.5%)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織(33/54，61.6%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。隨著BTCC臨床分期的增高，MIF陽性率呈上升趨勢，在淺表性和浸潤性癌組織中陽性率分別為66%、80%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.209)。隨著病理分級的增加，MIF陽性率分別為G1(53.6%)、G2(73.0%)、G3(90.4%)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)。復(fù)發(fā)性癌組織中MIF陽性率高于初發(fā)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。MIF陽性表達(dá)率在性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤數(shù)量的患者之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

圖1 BTCC及正常膀胱黏膜組織中CD31、MIF和VEGF的表達(dá) SP×400

表2 MIF、VEGF表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 VEGF在BTCC組織中的表達(dá) VEGF陽性信號主要位于癌細(xì)胞胞質(zhì)中(圖1)，75例BTCC組織中，46例癌細(xì)胞呈陽性，MIF陽性率為61.3%。12例正常膀胱組織中均無表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中VEGF表達(dá)水平(12/21，57.1%)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織(34/54，63.0%)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.642)。隨著BTCC臨床分期的增高，VEGF陽性率呈上升趨勢，在淺表性和浸潤性癌組織中陽性率分別為50%、76%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)。隨著病理分級的增加，MIF陽性率分別為 G1(42.9%)、G2(65.4%)、G3(80.9%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022)。復(fù)發(fā)性癌組織中MIF陽性率明顯高于初發(fā)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。VEGF陽性表達(dá)率在性別、年齡、腫瘤大小及數(shù)量的患者之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

2.4 MIF與VEGF的相關(guān)性 75例 BTCC組織中，兩者均表達(dá)陽性的有38例，均無表達(dá)的有14例。采用Spearman秩相關(guān)分析后，兩者在BTCC組織中表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.330，P=0.004)，見表3。

2.5MIF、VEGF與MVD的關(guān)系 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MIF、VEGF陽性例數(shù)MVD值高于陰性例數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.001)，見表4。

表3 MIF與VEGF在BTCC中的表達(dá)(n)

表4 MIF、VEGF與MVD的關(guān)系(±s)

表4 MIF、VEGF與MVD的關(guān)系(±s)

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3 討論

近年來，研究［1］表明MIF在腫瘤演變過程中發(fā)揮著重要作用，無論在腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移還是腫瘤血管形成過程中都扮演著重要角色。Meyer-Siegler et al［3］發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞株 HT-1376 中存在MIF高表達(dá)現(xiàn)象;而通過對細(xì)胞加以外源性的MIF抗體或抑制劑后，其分泌受到抑制，同時(shí)該腫瘤細(xì)胞增殖明顯減弱，這表明MIF可能在促進(jìn)BTCC癌細(xì)胞的增殖過程中起重要作用。Liu et al［4］研究亦發(fā)現(xiàn)，MIF高表達(dá)與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，經(jīng)MIF抑制劑處理后腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力明顯降低。此外，相關(guān)研究［5－6］顯示多種腫瘤中MIF的表達(dá)水平同P53蛋白、VEGF蛋白等的表達(dá)呈正相關(guān)，而這些蛋白均被認(rèn)為在腫瘤的增殖、分化及血管形成等過程中扮演著重要角色。

本研究采用RT-qPCR、免疫組化方法分別檢測MIF在BTCC中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示MIF在膀胱癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常黏膜組織。通過對免疫組化染色結(jié)果進(jìn)一步分析顯示，MIF的表達(dá)水平在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，高級別明顯高于低級別。這間接提示MIF蛋白在BTCC組織的生長、分化以及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為過程可能發(fā)揮著重要作用，高濃度的MIF有可能促進(jìn)上述一系列過程的發(fā)生。目前，RT-qPCR結(jié)果顯示MIF mRNA表達(dá)量在進(jìn)展期癌組織中明顯高于早期癌組織，而免疫組化則顯示MIF蛋白表達(dá)水平與臨床分期無關(guān)。因此，在BTCC組織中MIF mRNA的表達(dá)與MIF蛋白的表達(dá)并非完全一致，這一現(xiàn)象在許多基因中普遍存在［7］。

實(shí)體腫瘤的生長有賴于腫瘤新生血管的形成，并且腫瘤新生血管的形成也是其轉(zhuǎn)移的病理生理基礎(chǔ)。血管形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，在此過程中需要諸多因素的參與，如VEGF、血管生成素、堿性成纖維生長因子(bFGF)及環(huán)氧合酶-2等，其中VEGF所扮演的角色最為重要，它能夠與血管內(nèi)皮特異性相結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生、增強(qiáng)血管通透性，是作用最強(qiáng)的血管生成因子之一［8］。因此，其在腫瘤的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移中起著重要作用。本研究RT-qPCR結(jié)果顯示，癌組織中VEGF mRNA的平均表達(dá)量高于正常組織，且浸潤性癌組織中mRNA平均表達(dá)量高于表淺性。免疫組化法結(jié)果顯示在不同分期、分級的腫瘤組織中，VEGF的表達(dá)水平存在差異，即分化越低、分期越晚的腫瘤組織中其含量越高。且對于復(fù)發(fā)性癌組織，VEGF表達(dá)明顯高于初發(fā)性，提示VEGF在BTCC復(fù)發(fā)時(shí)血管的形成和腫瘤發(fā)展同樣具有重要作用;但VEGF表達(dá)水平與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性。筆者推測，這與腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制相對復(fù)雜有關(guān)，單一因素并不能反映出其主要生物學(xué)特性，此外，本研究樣本量相對較少也可能是影響因素之一。

在MIF表達(dá)陽性組織中，VEGF和MVD表達(dá)均明顯增高，Spearman相關(guān)分析顯示MIF與二者呈正相關(guān)關(guān)系。提示MIF可能促進(jìn)BTCC組織中VEGF的表達(dá)，從而達(dá)到間接促進(jìn)腫瘤組織微血管形成的作用。Cheng et al［6］在宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，MIF與其受體CD74的高表達(dá)能夠增加VEGF的表達(dá)，并指出MIF在宮頸癌的腫瘤血管形成中扮演著重要的角色。Rubio et al［9］研究指出，腫瘤組織中 MVD可能成為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后的一個(gè)新的指標(biāo)。本研究顯示MVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而另一方面，MIF與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和微血管形成均成明顯的正相關(guān)性。因此，MVD是否能夠直接促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移尚不明確，可能為一個(gè)伴隨關(guān)系，兩者之間相互作用關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，MIF與VEGF的高表達(dá)且協(xié)同作用可能在BTCC的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)方面具有重要作用，且MIF可能是影響B(tài)TCC腫瘤組織淋巴轉(zhuǎn)移、微血管形成和VEGF表達(dá)的重要因素，進(jìn)一步研究其作用機(jī)制可能成為BTCC分子靶向治療中新的切入點(diǎn)。

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