肝癌患者血清miR-106b的表達變化及其臨床意義

孟凡龍，莢衛東，許戈良，李建生，王 偉，孫其愷

肝細胞癌(簡稱肝癌)是世界范圍內第五大常見腫瘤，在腫瘤相關死亡原因中居第3位［1］，由于傳統檢查手段對肝癌的診斷效率并不令人滿意，多數患者因出現癥狀而就診時已失去了手術治療的機會，導致肝癌的總體預后很差，因此尋找新的更靈敏特異的肝癌標志物具有重要意義。近來研究［2－3］顯示循環miRNA在腫瘤等疾病的診斷及預后中具有重要應用價值，正成為疾病標志物研究的熱點。有研究［4－5］報道 miR-106b在肝癌組織中表達升高，且與肝癌的增殖及侵襲轉移相關，但其在血清中的表達情況尚未見報道。因此，該研究擬通過應用實時熒光定量 PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測miR-106b在肝癌患者血清中的表達情況并分析其與肝癌臨床病理特征的相關性，初步探討其是否具有成為肝癌診斷及預后的標志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2012年8月～2013年3月安徽醫科大學附屬省立醫院收治的47例經術后病理確診的乙肝陽性肝癌患者(肝癌組)，其中男37例，女10例，年齡(55.4±10.7)歲;22例慢性乙肝或慢性乙肝后肝硬化患者(慢性肝病組)，其中男17例，女5例，年齡(53.6±11.8)歲;31例各項指標均正常且自述無腫瘤相關病史的健康體檢者(正常對照組)，其中男24例，女7例，年齡(51.8±12.3)歲。

1.2 主要試劑與儀器 血清/血漿RNA提取試劑盒、miRNA逆轉錄試劑盒、miRNA SYBR Green PCR檢測試劑盒及Spike-In Control試劑盒均購自德國QIAGEN公司;miR-106b特異性上游引物是根據miRBase數據庫(網址 http://www.mirbase.org/)公布的序列，應用Oligo 7軟件設計并由Invitrogen(美國)公司合成的，序列為5’-TAAAGTGCTGACAGTGCAGAT-3’;普通 PCR儀購自德國 Biometra公司;ABI 7500 Real Time PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 血清樣本的收集 采集患者清晨空腹靜脈血3～4 ml，室溫靜置30 min充分凝結，4℃ 下3 100 r/min離心15 min，將上清液于4℃ 下13 200 r/min離心10 min去除殘余細胞成分，將所獲血清以300 μl/管分裝后置于－80℃保存備用。

1.3.2 血清總RNA提取 從－80℃冰箱取出血清樣本后迅速置于37℃水浴1 min解凍，取200 μl血清按照血清RNA提取試劑盒操作說明書提取血清總RNA，立即進行逆轉錄。

1.3.3 cDNA第一鏈合成 按照逆轉錄試劑盒說明書進行加尾法逆轉錄，反應結束后將獲得的10 μl cDNA以5 μl/管分裝于EP管后置于－80℃保存備用。

1.3.4 Real Time-PCR 按照 miRNA SYBR Green PCR檢測試劑盒說明書操作，反應體系共20 μl，反應條件為:95℃ 15 min后，以94℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 34 s進行40個循環，70℃時采集熒光信號，循環結束后繪制熔解曲線并對產物行瓊脂糖凝膠電泳。每個反應均重復3次取平均值。根據文獻［6］報道，以提取RNA時所加外參Cel-miR-39作為定量參照，以 2－ΔCt法計算血清中目標miRNA的相對表達量，其中ΔCt=Ct(miR-106b)－Ct(Cel-miR-39)。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析，所有數據均以中位數(四分位數)表示，各組數據經對數轉化后基本符合正態分布，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗，兩組數據的比較采用獨立樣本t檢驗。采用Medcalc軟件繪制血清miR-106b用于肝癌區分對照組的ROC曲線并計算曲線下面積(AUC)、敏感度及特異度。

2 結果

2.1 qRT-PCR法檢測結果 所有樣本均可檢出Cel-miR-39及miR-106b，兩種產物熔解曲線均為單峰，Tm值分別為75.75℃與75.51℃，產物瓊脂糖凝膠電泳條帶均位于80～100 bp，見圖1。

2.2 各組血清miR-106b表達情況 肝癌組、慢性肝病組及正常對照組間血清miR-106b比較差異有統計學意義(F=25.454，P＜0.01)，肝癌組血清miR-106b相對表達量［5.469×10－3(3.362×10－3，11.840×10－3)］分別較正常對照組［1.572×10－3(0.698×10－3，2.634 ×10－3)］及慢性肝病組［2.430 ×10－3(1.389 ×10－3，3.974 ×10－3)］顯著升高(P＜0.01)，慢性肝病組患者血清miR-106b相對表達量較正常對照組有升高趨勢，但差異無統計學意義，見圖2。

2.3 血清miR-106b表達量與肝癌臨床病理特征的關系 統計分析結果顯示腫瘤細胞低分化者較中高分化者血清miR-106b相對表達量高(P＜0.05)，有脈管侵犯者較無脈管侵犯者相對表達量高(P＜0.05)，TNM分期Ⅲ/Ⅳ期患者較Ⅰ/Ⅱ期患者相對表達量高(P＜0.05)。而與患者年齡、性別、病灶多少、腫瘤大小及血清AFP水平均無明顯相關性，見表1。

圖1 qRT-PCR法檢測結果

圖2 血清miR-106b在各組間的相對表達量(橫線代表均值)

表1 肝癌患者血清miR-106b相對表達量與臨床病理特征的關系

2.4 血清miR-106b的診斷價值 ROC曲線分析顯示，血清miR-106b區分肝癌患者與正常人AUC為0.868(95%CI:0.773 ～0.934，P ＜0.01)，截斷值取2.262×10－3時，敏感度與特異度分別為87.2%與74.2%;血清miR-106b區分肝癌患者于慢性肝病患者的AUC為0.791(95%CI:0.676～0.880，P ＜0.01)，截斷值取3.629 ×10－3時，敏感度與特異度分別為72.3%與77.3%。血清miR-106b區分慢性肝病與正常對照的AUC值為0.654(95%CI:0.511～0.779，P ＜0.05)，截斷值取 2.067×10－3時，敏感度與特異度分別為63.6%與67.7%，見圖3。

3 討論

微小RNA(miRNA)是新發現的一類短鏈非編碼RNA，可以對基因表達進行轉錄后調控，在細胞各項正常生命活動及包括腫瘤在內的各種疾病的發生發展中發揮重要調節作用。Lawrie et al［7］首次在血清中發現miRNA，之后越來越多的研究證實外周血及其他體液中含有穩定存在的miRNA，提示其可能成為理想的血清學標志物，在腫瘤等疾病的診斷及預后中具有重要的應用前景。肝癌在全球發病率高、預后差，而目前最主要的診斷標記物AFP的敏感度較低，且區分肝癌與乙型肝炎或肝硬化的能力較差，因此，探究循環miRNA在肝癌診斷及預測預后方面的應用價值正日益成為研究的熱點。

miR-106b基因位于人第7號染色體長臂上，是miR-106b～93～25簇的組成部分，目前已有文獻報道其在神經膠質瘤［8］、前列腺癌［9］等多種腫瘤中表達上調，提示其發揮著癌基因的作用。在肝癌方面，Shen et al［4］研究發現 miR-106b在肝癌細胞系及肝癌組織中相對于正常肝細胞及正常肝組織表達均顯著升高，并可以抑制APC基因表達促進肝癌細胞的增殖。而Yau et al［5］進一步研究發現miR-106b的高表達與E-Cadherin等上皮細胞標志物的低表達及N-Cadherin等間質細胞標志物的高表達相關，提示其可能通過促使肝癌細胞發生上皮間質轉化(EMT)進而促進肝癌的侵襲及轉移。但上述研究均是基于肝癌組織及細胞系，miR-106b在肝癌患者血清中表達是否異常，以及其能否作為肝癌診斷及預后標志物，國內外尚未見相關報道。

圖3 血清miR-106b ROC圖

本研究成功檢測了血清中miR-106b的表達量，實驗產物各項特征均與試劑盒說明書提供的參考值一致。結果顯示，血清miR-106b表達水平在肝癌患者中較正常對照組及慢性肝病組均顯著升高，與之前報道在肝癌組織及細胞系中的表達情況一致。分析表明血清miR-106b在TNM分期較晚、分化程度較低及有脈管侵犯等預后不良患者中表達更高，提示其可能是患者預后的敏感指標。ROC曲線分析顯示血清miR-106b用于區分肝癌與正常人時敏感度及特異度分別達到87.3%及74.2%，而文獻［10］統計顯示AFP診斷敏感度與特異度約為70%與89%，比較而言血清miR-106b敏感度較高，但特異度較低，而本研究顯示患者AFP水平與血清miR-106b表達量之間并無相關性，提示兩者在診斷肝癌方面可能存在一定互補性，進一步研究可以嘗試聯合檢測血清miR-106b與AFP以提高診斷敏感度與特異度。值得注意的是，miR-106b在區分肝癌與慢性肝病患者時也具有較高的敏感度及特異度，提示其可用于慢性肝炎及肝硬化患者等肝癌高危人群的篩查，以提高肝癌早期診斷率。

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［4］Shen G，Jia H，Tai Q，et al.miR-106b downregulates adenomatous polyposis coli and promotes cell proliferation in human hepatocellular carcinoma［J］.Carcinogenesis，2013，34(1):211 －9.

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［10］Zhou Y，Yin X，Ying J，et al.Golgi protein 73 versus alpha-fetoprotein as a biomarker for hepatocellular carcinoma:a diagnostic meta-analysis［J］.BMC Cancer，2012，12:17.