PCR法檢測大腸桿菌的增殖條件優化研究

呂曉萌，胡文忠 ，馮敘橋 ，何煜波，董 妍

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽 110866;2.大連民族學院生命科學學院，遼寧大連 116600;3.渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，技術研究中心，遼寧錦州 121013;4.大連工業大學食品學院，遼寧大連 116034）

1971年，大腸桿菌首次被確認為一起食物中毒的病原菌，共使400人受到感染［1］。大腸桿菌主要存在于溫血動物的腸道內，中國及許多國家將其作為食品衛生檢驗標準［2－4］。一旦在食品中出現，則意味著食品中存在某些腸道病原菌，而這些病原菌可能導致人們腹瀉、嘔吐，甚至死亡等。因此，大腸桿菌快速檢測對于保障人們食用食品的安全以及預防食源性疾病的傳播具有重要意義。目前，最常用的大腸桿菌快速檢測方法就是PCR法，該法具有檢測快速、操作簡便等特點。由于食品中所含大腸桿菌的數量往往較少，所以在對食品中的大腸桿菌進行PCR檢測前，通常要進行前增殖。目前，增殖的時間一般為12h左右［5－7］，而對于采用不同增殖方法對增殖效果影響鮮有報道。本實驗主要比較振蕩與靜置方式及在培養基中加入添加劑對大腸桿菌增殖效果的影響，旨在建立一種簡單、省時的大腸桿菌增殖方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌（Escherichia coli，菌株:CMCC44102）由大連民族學院生命科學學院食品安全實驗室提供。

Tris、Na2EDTA·2H2O、冰乙酸、氫氧化鈉、瓊脂糖、酵母提取物、NaCl、胰蛋白胨、瓊脂、乳糖、甘露醇等均為國產分析純;Lysis Buffer（編碼:D304）、TaKaRa Ex Taq?（編碼:DRR01AM），DL2000 DNA Marker（編碼:3427A）購自寶生物工程（大連）有限公司;GelRed染料（41003）Biotium原裝。

DYY－11型電泳儀電源、DYCP－31F型電泳儀 北京市六一儀器廠;TC－512型PCR儀 Techne公司;BioSpectrum 310凝膠成像系統 美國UVP公司;數顯恒溫水浴鍋HH－6 國華電器有限公司;TGL－16C型高速臺式離心機 江蘇省興華市分析儀器廠;超凈工作臺（2HJH－C2112B） 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 在無菌條件下，將大腸桿菌劃線接種于LB固體培養基中，37℃培養24h，轉接2次后挑取單菌落接種到LB液體培養基中，37℃培養24h后用無菌的生理鹽水對其進行梯度稀釋至10CFU/mL，備用。

1.2.2 培養模式的選擇 取10CFU/mL的大腸桿菌菌懸液1mL加入到LB液體培養基中，于37℃分別進行靜止培養和150r/min振蕩培養，分別培養4、6、8和24h，從每份樣品中取1mL進行梯度稀釋，然后分別從梯度稀釋的菌懸液中取0.1mL涂布于LB培養基上，于37℃培養24h后進行平板計數，比較不同培養模式的增殖效果。

1.2.3 添加劑的選擇 分別取10CFU/mL的大腸桿菌菌懸液1mL加入到含有不同濃度的甘露醇（0.1、0.2、0.4、0.6g/100mL）、乳 糖 （0.2% 、0.5% 、1.0% 、1.5%）與二者復配液（0.2g/100mL+1% 、0.3g/100mL+1% 、0.4g/100mL+1% 、0.2g/100mL+1.2%）的 LB液體培養基中，于37℃、150r/min的振蕩培養，分別培養4、6、8和24h。從每份樣品中取1mL進行梯度稀釋，然后分別從梯度稀釋的菌懸液中取0.1mL涂布于LB培養基上，于37℃培養24h后進行平板計數，比較不同添加劑對大腸桿菌增殖效果的影響。

1.2.4 大腸桿菌的PCR檢測 常規PCR的引物參照參照文獻［8］中的引物序列，詳見表1，引物由大連寶生物公司合成。

表1 實驗所采用的引物序列Table 1 Sequence of specific primers

PCR反應條件根據參考文獻［9］進行調整:PCR反應體系為 50μL，其中包括 0.25μL Taq 酶、5μL 10× Buffer（Mg2+free）、4μL dNTP Mixture、5μL 模板DNA、引物UidA1和UidA2各1μL，其余用雙蒸水補足到50μL。PCR反應程序為94℃預變性5min后進入 PCR 循環:94℃變性30s，60℃退火30s，72℃ 延伸1min，35個循環，72℃充分延伸7min。用1%瓊脂糖凝膠，在電壓95V下對PCR產物進行電泳，采用紫外分析儀觀察結果。

1.3 分析處理

所有實驗數據為3次重復實驗結果的平均值。實驗數據采用SPSS19.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 培養模式的選擇

從表2可以看出，大腸桿菌使用LB液體培養基37℃，150r/min振蕩培養比LB液體培養基靜止培養的增殖效果要好。大腸桿菌培養到4h時，振蕩培養能夠顯著的提高增殖效果（p＜0.05）;當培養4h后，振蕩培養能夠極顯著的提高增殖效果（p＜0.01）。培養6h后，振蕩培養的大腸桿菌菌量均比靜止培養的菌量高出一個數量級。這可能是由于大腸桿菌為兼性厭氧菌，振蕩培養可增加溶氧，保證大腸桿菌得到充足的溶解氧，使菌體和培養液充分接觸，從而使大腸桿菌快速繁殖。結果表明，振蕩培養能提高大腸桿菌的增殖效果。

表2 靜止培養與振蕩培養對大腸桿菌增殖的影響（CFU/mL）Table 2 Effects of shaking culture and static culture on pre－enrichment of Escherichia coli（CFU/mL）

2.2 添加劑的選擇

2.2.1 甘露醇用量對大腸桿菌增殖效果的影響 培養基的滲透壓對菌體生長起著至關重要的作用。滲透壓過低會使細胞吸水膨脹，甚至是破裂，而甘露醇能提高培養基的滲透壓。

由表3可看出，適宜濃度的甘露醇能提高大腸桿菌的增殖效果。較低濃度的甘露醇并不能對增殖起到明顯作用。當甘露醇濃度為0.1g/100mL時，培養8h后增殖效果要優于振蕩培養的增殖效果。當甘露醇濃度為 0.2～0.4g/100mL 時，甘露醇可促進大腸桿菌的生長，其中濃度為0.4g/100mL的甘露醇增殖效果較為明顯。當甘露醇濃度為0.6g/100mL時，對大腸桿菌的生長起到一定抑制作用。

表3 甘露醇用量對大腸桿菌增殖的影響（CFU/mL）Table 3 Effect of mannitol on pre－enrichment of Escherichia coli（CFU/mL）

2.2.2 乳糖用量對大腸桿菌增殖效果的影響 糖類可以提供微生物生長所必需的碳源。將不同濃度的乳糖添加到LB液體培養基中，考察乳糖用量對大腸桿菌增殖效果的影響，結果見表4。

表4 乳糖用量對大腸桿菌增殖的影響（CFU/mL）Table 4 Effect of lactose on pre－enrichment of Escherichia coli（CFU/mL）

由表4可知，乳糖可促進大腸桿菌的生長。隨著乳糖濃度的增大，大腸桿菌的增殖效果均有不同程度的提高。當乳糖濃度低于1.0%時，隨著乳糖濃度的不斷增大，大腸桿菌的增殖效果越益明顯。乳糖濃度為1.0%時，大腸桿菌增殖效果最好，培養24h后，較LB基礎培養基的活菌數提高了4.1倍。當乳糖濃度大于1.0%時，其對大腸桿菌有增殖效果，但效果不及1.0%乳糖。

2.2.3 甘露醇和乳糖復配使用對大腸桿菌增殖效果的影響 由表5看來，甘露醇和乳糖復配使用對大腸桿菌的增殖效果優于二者單獨使用。當甘露醇和乳糖復配使用時，從4h起大腸桿菌的增殖數量要比LB基礎培養基振蕩培養的增殖量高出一個數量級。尤其是當0.3g/100mL甘露醇+1%乳糖復配培養8h后，活菌數為1.7×108CFU/mL，較LB基礎培養基的活菌數高出26.6倍，較添加0.4g/100mL甘露醇 LB培養基的活菌數提高了14.2倍，較添加了1%乳糖的LB培養基的活菌數提高了6.3倍;培養24h后，活菌數達到1.2×1011CFU/mL，較LB基礎培養基的活菌數提高了23.5倍。由此可見，甘露醇和乳糖復配使用產生了協同作用，增強了大腸桿菌的增殖效果。

2.3 大腸桿菌的PCR檢測結果

以 UidA1、UidA2 為引物，將添加了 0.3g/100mL甘露醇和1%乳糖的LB增殖培養基增殖4、6、8、24h后的菌液作為模板，對大腸桿菌進行PCR擴增，成功擴增出大小為147bp的特異性條帶。根據電泳條帶的亮度可知，增殖4h就可檢測出大腸桿菌。

3 結論

目前，對食品中大腸桿菌的PCR檢測方法的報道中，不同研究者用的增殖培養基不同，增殖效果也不盡相同。郝江燕［9］等人用PCR方法檢測鮮活農產品中的大腸桿菌時采用的增殖培養基是LB培養基，增殖時間為 6h。Rubén Gordillo［10］采用的是 2% 亮綠膽鹽肉湯培養基，增殖時間為6h。胡慧［5］等人對大腸桿菌O157∶H7進行增殖時將菌株于肉湯培養基中增殖培養過夜。大腸桿菌PCR檢測的增殖時間大多都多于4h，而本研究只要增殖4h后即可檢出。本研究旨在比較振蕩培養與靜止培養、甘露醇與乳糖對大腸桿菌的增殖效果的影響，得出結論為振蕩培養相對于靜止培養能對大腸桿菌的增殖起到一定的作用，乳糖、甘露醇與乳糖復配使用均能提高大腸桿菌的增殖效果。隨著乳糖濃度的增加，大腸桿菌的增殖效果先強后弱，當濃度達到1%時，增殖效果最好;濃度高于1%時，增殖效果反而有所下降。隨著甘露醇濃度的增加，大腸桿菌的增殖效果是先升后降，當濃度達到0.6g/100mL時，對大腸桿菌的增殖不但沒有效果，反而有所抑制，可能是由于甘露醇的加入量過高時，培養基中的碳氮比失去平衡而影響了菌體的正常生長。當二者復配使用時，增殖效果要優于二者單獨使用，其中在LB培養基中添加0.3g/100mL甘露醇和1%乳糖，于37℃、150r/min的振蕩培養，對大腸桿菌的增殖效果最好。

表5 甘露醇和乳糖復配使用對大腸桿菌增殖效果的影響Table 5 Effect of mannitol combination with lactose for pre－enrichment of Escherichia coli

圖1 PCR電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoretogram of PCR amplification products

近年來，隨著食品安全事件頻發，食源性致病菌的檢測顯得極其重要。傳統的檢測方法存在耗時長、工作量大等特點。本實驗通過對大腸桿菌前增殖方法的研究發現，利用添加0.3g/100mL甘露醇和1%乳糖的LB培養基對大腸桿菌進行4h的前增殖后，結合常規PCR即可快速地檢測出大腸桿菌，從增殖到檢測整個過程只需要6h左右。

［1］白鳳翎.國際食品中大腸桿菌相關檢驗標準探究［J］.食品科技，2005，9:30－33.

［2］SN/T 0169－2010，進出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢測方法［S］.

［3］EC 1441－2007，Amending Regulation（EC）No 2073/2005 on Microbiological Criteria for Foodstuffs［S］.

［4］ AOAC966.24，Coliform Group and Escherichia coli Microbiological Method First Action 1966 Final Action 1971［S］.

［5］胡慧，陳雅君，段志剛，等.大腸桿菌O157∶H7特異基因的實時熒光定量 PCR 檢測［J］.食品科學，2011，32（12）:278－282.

［6］席美麗，只帥，王小璞，等.食源性大腸桿菌的PCR檢測［J］.西北農業學報，2011，20（12）:188－191，196.

［7］周微，張偉欽，付宇，等.熒光定量PCR方法快速檢測原料乳中的大腸桿菌［J］.中國乳品工業，2009，37（11）:39－42.

［8］Andre′e F Maheux，Francois J Picard.Analytical comparison of nine PCR primer sets designed to detect the presence ofEscherichia coli/Shigella in water samples［J］.Water Research，2009，43（12）:3019－3028.

［9］郝江燕，胡文忠，何煜波，等.鮮活農產品中大腸桿菌的PCR 檢測［J］.食品工業科技，2013，34（17）:150－153.

［10］Rubén Gordillo，Juan J Córdoba，María J Andrade，et al.Development of PCR assays for detection ofEscherichia coliO157∶H7 in meat products［J］.Meat Science，2011，88（4）:767－773.