堿性蛋白酶酶解谷朊粉制備谷朊粉蛋白多肽的研究

趙 源，劉愛國，吳子健，紀(jì)瑞慶

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

谷朊粉是小麥淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量非常豐富，含量能夠達到80%以上，且氨基酸組成比較齊全，鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)含量較高，是營養(yǎng)豐富、物美價廉的植物性蛋白源[1]。但谷朊粉蛋白是一種缺乏親水性氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，這導(dǎo)致谷朊粉蛋白的水溶性不高，因而使其應(yīng)用受到很大的局限性[2]。堿性蛋白酶是一種限制性內(nèi)切酶，在堿性蛋白酶的作用下，谷朊粉中蛋白質(zhì)會伴隨著結(jié)構(gòu)的重組變化，使一些原來包埋在谷朊粉蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露，谷朊粉蛋白會被水解成具有一定功能性的肽鏈，并且可以極大地提高其溶解性，使其具有新的營養(yǎng)、功能和生物特性[3]，因而使其能夠被更加廣泛的應(yīng)用于飼料和食品行業(yè)[4]。

近年來國內(nèi)外對于谷朊粉的酶法水解研究很多，國外對于谷朊粉酶解物抗氧化肽、降血壓肽谷氨酰胺肽的制備也有較多報道[5-8]。如洪宇波等[9]采用堿性蛋白酶水解小麥谷朊粉制備ACE抑制肽，并對工藝進行優(yōu)化研究，優(yōu)化后其抑制率比優(yōu)化前提高40.7%。劉立芳等[10]以谷朊粉為原料，采用中性蛋白酶制備抗氧化多肽，并對酶解工藝進行優(yōu)化。結(jié)果表明，對中性蛋白酶酶解谷朊粉制備抗氧化多肽的影響順序依次為酶解溫度＞加酶量＞酶解時間；通過響應(yīng)面分析優(yōu)化酶解條件為底物濃度8%，加酶量2800U/g，溫度52℃，時間280min，此時酶解液羥自由基清除率達到65.3%，多肽含量為60.4mg/mL。此外，林琳[11]、閏桂強等[12]也分別研究了谷朊粉酶解物的體外抗氧化性。

本實驗通過對堿性蛋白酶催化酶解小麥谷朊粉的條件進行系統(tǒng)的研究，確定堿性蛋白酶酶解小麥谷朊粉蛋白的最佳工藝條件，為小麥谷朊粉蛋白生物活性肽的制備以及其在生物、食品和飼料工業(yè)中的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷朊粉 市售；堿性蛋白酶 廣州市博仕奧生物科技有限公司；茚三酮 上海伯奧生物科技有限公司；NaCl、NaOH、HCl等試劑 分析純級，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

EMS-9A磁力加熱攪拌器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；AUW120D電子天平 SHIMADZU公司；3-18K低溫高速離心機 德國Sigma公司；UDK159自動凱氏定氮儀 VELP SCIENTIFIC公司；FDU-810冷凍干燥機 日本東京理化公司；XMTB數(shù)顯式恒溫水浴鍋 北京市長風(fēng)儀器儀表公司；HD-5電腦紫外檢測儀、CXG-1層柜、BT-100恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 谷朊粉→NaOH溶液溶解→恒溫攪拌→加酶→恒溫攪拌（4℃，1h）→離心（4℃，7500r/min，15min）→棄沉淀取上清→透析除鹽（4℃，3.5ku，24h）→冷凍干燥（-72℃，24h）→谷朊粉蛋白多肽粗品。

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 粗蛋白含量的測定 凱氏定氮法（GB/T 5511-2008），蛋白質(zhì)換算系數(shù)為5.7。

1.2.2.2 脂肪含量的測定 參考GB/T 5009.5-2003。

1.2.2.3 水分含量的測定 參考GB/T 5009.3-2003。

1.2.2.4 淀粉含量的測定 參考GB/T 2019.4-2006。

1.2.2.5 灰分含量的測定 參考GB/T 5009.4-2010。

1.2.2.6 堿性蛋白酶的活力測定 堿性蛋白酶按福林酚法（GB/T 23527-2009）測定酶活。

1.2.2.7 水解度（DH）的測定 在中性和堿性的條件下采用pH-state法[13-16]。

pH-state法主要是基于蛋白質(zhì)水解過程中總是要伴隨質(zhì)子的釋放或吸收，質(zhì)子化的多少依賴于溶液的pH，通過加入用于維持體系pH的堿或酸量直接計算出水解度。計算公式如下：

式中：B：堿液的體積（mL）；Nb：堿液的濃度mol/L；α：是氨基的離解度；Mp：底物中蛋白質(zhì)總含量，g；htot：每克谷朊粉蛋白的肽鍵毫摩爾數(shù)，mmol/g；對小麥谷朊粉蛋白，htot取8.38；1/α取2.26[17]。

1.2.3 單因素實驗對谷朊粉蛋白酶解條件的研究

1.2.3.1 酶解時間對谷朊粉水解度的影響 稱取10g谷朊粉，按底物濃度[S]=10%的比例溶于0.1mol/L、pH=8.0的NaOH溶液中，在水浴鍋中水浴加熱保持至55℃，按酶濃度[E]/[S]=5%的比例加入堿性蛋白酶，攪拌，分別保持1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h，采用pH-state法分別測其在不同的酶解時間下的水解度。

1.2.3.2 底物濃度對谷朊粉蛋白水解度的影響 稱取10g谷朊粉，按底物濃度[S]=7%、8%、9%、10%、11%、12%的比例溶于0.1mol/L、pH=8.0的NaOH溶液中，在水浴鍋中水浴加熱保持至55℃，按酶濃度[E]/[S]=5%的比例加入堿性蛋白酶，攪拌，保持2.5h，采用pH-state法分別測其在不同底物濃度下的水解度。

1.2.3.3 酶濃度對谷朊粉蛋白水解度的影響 稱取10g谷朊粉，按底物濃度[S]=9%的比例溶于0.1mol/L、pH=8.0的NaOH溶液中，在水浴鍋中水浴加熱保持至55℃，按酶濃度[E]/[S]=2%、3%、4%、5%、6%、7%的比例加入堿性蛋白酶，攪拌，保持2.5h，采用pH-state法分別測其在不同酶濃度條件下的水解度。

1.2.3.4 溶液pH對酶解反應(yīng)的影響 稱取10g谷朊粉，按底物濃度[S]=9%的比例分別溶于0.1mol/L、pH=7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的NaOH溶液中，在水浴鍋中水浴加熱保持至55℃，按酶濃度[E]/[S]=4%的比例加入堿性蛋白酶，攪拌，保持2.5h，采用pH-state法分別測其在不同的溶液pH下的水解度。

1.2.3.5 溫度對酶解反應(yīng)的影響 分別稱取10g谷朊粉，按底物濃度[S]=9%的比例溶于0.1mol/L、pH=8.0的NaOH溶液中，在水浴鍋中水浴加熱保持至45、50、55、60、65℃，按酶濃度[E]/[S]=4%的比例加入堿性蛋白酶，攪拌，保持2.5h，采用pH-state法分別測其在不同的酶解溫度下的水解度。

1.2.4 正交法優(yōu)化制備谷朊粉蛋白多肽的酶解條件研究 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，為了進一步驗證和探索谷朊粉蛋白多肽最佳的酶解條件，以底物濃度、溶液pH、酶濃度、酶解溫度、酶解時間為因素，采用L16（45）的實驗方案進行正交實驗，L16（45）正交設(shè)計表格如表1所示。

表1 L16（45）正交實驗因素與水平表Table 1Factors and levels of orthogonal experiment L16（45）

1.2.5 利用Tricine SDS-PAGE測谷朊粉酶解多肽的分子量 將在最佳酶解條件下制得的谷朊粉蛋白多肽配制成1mg/mL的溶液，以相同的比例和上樣緩沖液混合振蕩，在沸水浴中煮沸10min，然后以10000r/min的速率離心15min。配制16.5%分離膠和5%的濃縮膠，每次上樣10μL，調(diào)節(jié)濃縮膠電壓至80V，分離膠電壓至150V，經(jīng)固定、染色、脫色后觀察分離膠上條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷朊粉的化學(xué)組成

谷朊粉的化學(xué)組成成分如表2所示。

表2 谷朊粉的化學(xué)組成（%）Table 2 The chemical compositions of wheat gluten（%）

2.2 酶活的測定

通過福林酚法測得實驗所用的堿性蛋白酶酶活為2.647×105U/g。

2.3 堿性蛋白酶酶解反應(yīng)的單因素實驗

2.3.1 酶解時間對谷朊粉水解度的影響 由圖1可知，隨著酶解時間的增長，谷朊粉蛋白水解度逐漸增大且增大速度較快，水解2.5h后酶解繼續(xù)進行，但水解的多是小分子部分，隨著酶不斷被消耗，活性降低，與酶作用的肽鍵逐漸減少，水解度變化不大。而且反應(yīng)時間過長，受美拉德反應(yīng)等的影響，獲得的肽溶液顏色加深、不良?xì)馕都訚猓源_定酶解最適宜的反應(yīng)時間為2.5h。

圖1 酶解時間對谷朊粉水解度的影響Fig.1 Effect of enzymolysis time on the hydrolysis degree of wheat gluten

2.3.2 底物濃度對谷朊粉蛋白水解度的影響 由圖2可知，當(dāng)?shù)孜餄舛冗^低時，雖然谷朊粉蛋白更加容易分散，但是單位質(zhì)量的酶所接觸的底物有限，造成水解度過低，不利于工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)；底物濃度太高，由于谷朊粉蛋白難溶于水，濃度過大會造成谷朊粉蛋白分散困難，甚至結(jié)團，阻礙了堿性蛋白酶與底物的充分接觸，水解度逐漸下降。當(dāng)?shù)孜餄舛萚S]=9%時水解度最高，水解度為22.90%。

圖2 底物濃度對谷朊粉水解度的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on the hydrolysis degree of wheat gluten

2.3.3 酶濃度對谷朊粉蛋白水解度的影響 由圖3可知，過少的酶，使反應(yīng)速度降低，無法得到多肽的高得率的產(chǎn)品。酶濃度高，會加速酶解反應(yīng)，但酶濃度到達一定水平以后水解程度就變化不明顯，酶量太大會干擾酶解物的組成[17]，并且大大增大成本，所以確定酶解反應(yīng)的酶濃度為4%。

圖3 酶濃度對谷朊粉水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on the hydrolysis degree of wheat gluten

2.3.4 溶液pH對酶解反應(yīng)的影響 酶解反應(yīng)都有最適的酸堿度，pH過低或過高都不利于酶活性的表達，造成酶解反應(yīng)水解度的降低，由圖4可知，隨著溶液pH的不斷增加，小麥谷朊粉的水解度先增大后變小，在pH=8.0時，谷朊粉的水解度最大。初步確定pH=8.0為谷朊粉蛋白酶解的最佳pH。

圖4 溶液pH對谷朊粉水解度的影響Fig.4 Effect of pH on the hydrolysis degree of wheat gluten

2.3.5 溫度對酶解反應(yīng)的影響 酶解反應(yīng)都有其最適溫度，一般在酶的最適溫度以下，隨著溫度的升高反應(yīng)物的能量和分子間有效接觸的頻率增加，因而反應(yīng)速度加快。溫度過高，酶分子的空間結(jié)構(gòu)由于能量的增加而發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活性的減弱或喪失，由圖5可知，隨著酶解溫度的升高，小麥谷朊粉的水解度先增大后變小，堿性蛋白酶的最適溫度在50～60℃，初步確定堿性蛋白酶酶解谷朊粉的最適溫度為55℃。

2.4 堿性蛋白酶酶解谷朊粉反應(yīng)的正交實驗

正交實驗結(jié)果及各因素對提取條件的極差分析如表3所示，正交實驗結(jié)果的方差分析如表4所示。

圖5 酶解溫度對谷朊粉水解度的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on the hydrolysis degree of wheat gluten

表3 正交實驗結(jié)果及極差分析Table 3 Results and intuitionm analysis of orthogonal experiment

由正交表極差分析k值可得，五個因素中均為第2個水平的數(shù)值最高，最優(yōu)組合為A2B2C2D2E2，即為酶解時間2.5h、底物濃度9%、酶濃度4%、pH=8.0、酶解溫度55℃；由極差分析結(jié)果可知：RD＞RE＞RC＞RB＞RA，因此，五個因素對谷朊粉水解度的影響的重要性依次為：pH、酶解溫度、酶濃度、底物濃度、酶解時間。

由表4的方差實驗分析結(jié)果可知：pH對谷朊粉水解度具有顯著的影響。

2.5 驗證實驗

根據(jù)優(yōu)化條件進行重復(fù)驗證實驗，稱取15g谷朊粉，按底物濃度[S]=9%的比例溶于0.1mol/L、pH=8.0的NaOH溶液中，在水浴鍋中水浴加熱保持至55℃，按酶濃度[E]/[S]=4%的比例加入堿性蛋白酶，攪拌，保持2.5h，采用pH-state法分別測其水解度為22.96%，在此條件下，酶解反應(yīng)水解度大幅提高。表明實驗中所設(shè)模型與實際情況相符，正交實驗結(jié)果數(shù)據(jù)可靠。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

2.6 利用Tricine SDS-PAGE測谷朊粉酶解多肽的分子量

圖6 谷朊粉蛋白多肽的Tricine SDS-PAGE圖譜Fig.6 Tricine SDS-PAGE pectrum of Gluten polypeptide

由圖6可知，谷朊粉經(jīng)堿性蛋白酶在最佳的酶解條件下所得的谷朊粉蛋白多肽的分子量分布范圍在8.04～50.12ku之間，且比較分散；在此酶解條件下，分子量為11.82ku的谷朊粉蛋白多肽含量最高，通過Bio-Rad公司的1D凝膠分析軟件quantity one，測得其占麥谷蛋白多肽總量的57.3%。

3 結(jié)論

本實驗研究了堿性蛋白酶酶解谷朊粉制備谷朊粉多肽的工藝，分析了酶解時間、底物濃度、酶濃度、pH、酶解溫度五個因素對堿性蛋白酶酶解小麥谷朊粉的水解度的影響，通過單因素實驗和正交實驗設(shè)計建立了堿性蛋白酶水解谷朊粉的數(shù)學(xué)模型，并以此模型進行優(yōu)化，得到堿性蛋白酶水解谷朊粉蛋白的最佳水解工藝為：酶解時間2.5h、底物濃度9%、酶濃度4%、pH=8.0、酶解溫度55℃，在此條件下其水解度達到22.96%，其中五個因素對谷朊粉水解度的影響的重要性依次為：pH＞酶解溫度＞酶濃度＞底物濃度＞酶解時間。在最佳酶解條件下制備的谷朊粉蛋白多肽粗品經(jīng)Tricine SDS-PAGE測得各組分蛋白多肽的分子量分布在8.04～50.12ku之間。此實驗可為今后研究谷朊粉蛋白活性肽以及谷朊粉蛋白多肽在食品和飼料行業(yè)中的運用提供廣泛參考依據(jù)，具有重大的意義。

[1]彭海萍，彭鳳霞.可食性小麥蛋白膜的研究[J].現(xiàn)代科技，2003（3）：42-44.

[2]何慧如，詹朝，馬美蓉，等.堿處理面筋蛋白功能之探討[J].食品科學(xué)（臺），1992（2）：241-252.

[3]齊軍茹，楊曉泉，彭志英.控制酶解小麥面筋蛋白的研究[J].食品工業(yè)科技，2003，24（9）：43-45.

[4]吳爽，朱科學(xué)，周慧明.酶解谷朊粉的研究進展[J].糧食與食品工程，2012（2）：39-44.

[5]Cornel H J.Partialin vitrodigestion of active gliadin related peptides in celiac disease[J].Journal of Protein Chemistry，1998，17（8）：739-744.

[6]Cornel H J.Partialin vitrodigestion of active gliadin related peptides in celiac disease[J].Journal of Protein Chemistry，1998，17（8）：739-744.

[7]Suetsuna K，Chen J R.Isolation and characterization of peptides With antioxidant activity derived from wheat gluten[J].Food Science and Technology Research，2002（32）：27-230.

[8]齊軍茹，王蘭，李瑜.中性蛋白酶對小麥面筋蛋白的水解改性研究[J].鄭州工程學(xué)院學(xué)報，2001（4）：46-49.

[9]洪宇波，史勁松，張衛(wèi)明，等.谷朊蛋白制備ACE抑制膚的酶解工藝優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（6）：15-20.

[10]劉立芳，徐懷德，王青林.中性蛋白酶酶解谷朊粉制備抗氧化多肽研究[J].西北農(nóng)林學(xué)報，2008，17（6）：281-285.

[11]林琳，張玲，崔鳳杰，等.雙酶法水解小麥面筋蛋白提高產(chǎn)物抗氧化活性[J].食品科技，2009，34（12）：186-190.

[12]閆桂強，王文兵，崔鳳杰，等.中性蛋白酶水解小麥面筋蛋白的條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2009（2）：178-180.

[13]Jens Adler-Nissen.Determinationof the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenestdfonic acid[J].A-gric Food Chem，1979，27（6）：1256-1262.

[14]Magdalena Karamac，Ryszard Amarowicz，Henryk Kostyra.Effectoftemtperature and enzyme/substrate ratio on the hydrolysisof peaprotein isolates by trypsin[J].Czech J Food Sci，2002，20（1）：1-6.

[15]Marquez M C，F(xiàn)ernandez V.pH-state method to evaluate the heat inactivation of subtilisin inhibitor in legumes[J].Chembiochem Eng Q，2002，16（1）：31-35.

[16]J Adler-Nissen.Enzymatic hydrolysis of food proteins[J].Process Biochemistry，1977，27（1）：18-23.

[17]孔祥珍，周惠明，王洪燕.堿性蛋白酶水解小麥面筋蛋白的研究[J].食品工業(yè)科技，2006，27（9）：104-105.