高效液相色譜法測(cè)定活血應(yīng)痛丸中橙皮苷含量

彭春梅，楊宏昕

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017)

活血應(yīng)痛丸為我院醫(yī)院制劑，由狗脊(砂燙去毛)、香附(醋制)、沒藥(醋制)、制草烏、蒼術(shù)(米泔水制)、陳皮、威靈仙7 味藥材組方，功能壯筋骨、活血脈、祛風(fēng)利濕，用于血脈凝滯、腰腿疼痛，風(fēng)濕麻木、關(guān)節(jié)酸痛，行步艱難。參照2010 年版《中國藥典(一部)》陳皮含量測(cè)定方法[1]132及有關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)合產(chǎn)品特點(diǎn)，在原有色譜條件基礎(chǔ)上，經(jīng)多次試驗(yàn)，確立了活血應(yīng)痛丸中陳皮所含橙皮苷的含量測(cè)定方法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Lab Alliance 高效液相色譜儀;Anastar 色譜工作站。活血應(yīng)痛丸(自制);橙皮苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為0721-200010);水為二次重蒸水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(250 m×4.6 mm，5 μm)，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動(dòng)相:以甲醇-醋酸-水(35 ∶4 ∶61)，檢測(cè)波長(zhǎng):283 nm;柱溫:室溫;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。在此條件下，理論塔板數(shù)按橙皮苷色譜峰計(jì)算不得低于2 000，橙皮苷與其他組分色譜峰均達(dá)到基線分離(見圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，以甲醇溶解并配制成每1 mL含0.2 mg 的對(duì)照品溶液。取樣品適量，研細(xì)，稱取約1.3 g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚(60 ～90 ℃)80 mL，加熱回流2 ～3 h，棄去石油醚，藥渣揮干，加甲醇80 mL，再加熱回流至提取液無色，放冷，濾過，濾液置100 mL 容量瓶中，用少量甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗液濾入同一容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾液經(jīng)(0.45 μm)微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。取不含陳皮的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn):取2.2 項(xiàng)下3 種溶液，按擬訂的色譜條件依法進(jìn)樣。按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中“橙皮苷含量測(cè)定”項(xiàng)下方法操作，對(duì)不含陳皮的陰性樣品及空白溶劑進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與供試品及對(duì)照品溶液色譜中橙皮苷峰保留時(shí)間相應(yīng)位置上無色譜峰，表明方中其他成分對(duì)樣品橙皮苷含量測(cè)定無干擾(見圖1)。

線性關(guān)系考察:精密吸取對(duì)照品溶液(0.196 g/L)2，6，10，14，18 μL，分別按擬訂的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)、橙皮苷進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程Y=1 061 471 X+10 567.5，r=0.999 9(n=5)。結(jié)果表明，橙皮甘進(jìn)樣量在0.392 ～3.528 μg 范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液10 μL，于0，3，6，9，12 h 時(shí)進(jìn)樣，依法測(cè)定。結(jié)果峰面積的RSD 為1.79%(n=5)，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一份供試品溶液10 μL，按擬訂的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5 次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的RSD=1.77%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào)為050815)5 份，按供試品溶液制備方法平行處理并測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果含量平均值為11.03 mg/g，RSD 為1.66%(n=5)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取已知含量為11.03 mg/g(批號(hào)為050815)的樣品1.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，以兩份為1組，共3 組，每組分別加入橙皮苷對(duì)照品11.2，14.0，16.8 mg，按供試品溶液制備方法制備待測(cè)溶液，依法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 橙皮苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果( n=6)

取3 批中試樣品，依法制備供試品溶液并按擬訂的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見表2。含量限度暫定為:本品含陳皮以橙皮苷(C28H34O15)計(jì)，水丸每1 g 不得少于7.0 mg，水蜜丸每1 g 不得少于4.67 mg。

表2 3 批中試樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件選擇

測(cè)定波長(zhǎng)選擇:稱取橙皮苷對(duì)照品適量，配成每1 mL 含0.2 mg的溶液，在200 ～500 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，參照2010 年版《中國藥典(一部)》陳皮項(xiàng)下橙皮苷含量測(cè)定波長(zhǎng)，結(jié)合紫外掃描結(jié)果，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。

耐用性考察[1]附錄36:在擬訂條件下，用3 種不同類型的色譜柱(Discovery，Diamonsil，Zorbax SB-C18)進(jìn)行試驗(yàn)，均能得到很好的分離效果，且流動(dòng)相比例改變時(shí)也不影響含量測(cè)定結(jié)果。

流動(dòng)相選擇[2]:參照2010 年版《中國藥典(一部)》陳皮項(xiàng)下橙皮苷含量測(cè)定方法，確定為甲醇-醋酸-水(35 ∶4 ∶61)。

3.2 提取溶劑選擇

根據(jù)橙皮苷易溶于水、甲醇、乙醇的化學(xué)性質(zhì)，以橙皮苷提取量為考察指標(biāo)進(jìn)行考察。取本品適量，研細(xì)，稱取約1.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇或乙醇25 mL，稱重，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)20 min，取出，放冷，稱重(補(bǔ)足原重)，搖勻，濾過，濾液經(jīng)(0.45 μm)微孔濾膜濾過，依法測(cè)定含量。結(jié)果甲醇提取量為2.35 mg/g，乙醇提取量為0.26 mg/g，故選擇甲醇為提取溶液。

3.3 提取方法選擇

取本品適量，研細(xì)，稱取約1.3 g，精密稱定，分別采用超聲提取[置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)20 min，取出，放冷，濾過，濾液置100 mL容量瓶中]、索氏提取(文中方法)、回流提取(置圓燒瓶中，精密加入甲醇25 mL，加熱駕流30 min，搖勻，濾過，定容至25 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，濾液經(jīng)(0.45 μm)微孔濾膜濾過，即得供試品溶液，分別注入液相色譜儀中測(cè)定，結(jié)果超聲、索氏、回流提取方法所得樣品中橙皮苷含量分別為8.85，11.21，1.46 mg/g。可見，索氏提取法提取的樣品橙皮苷含量最高，基本提取完全，可作為試驗(yàn)的提取條件。

方法學(xué)考察結(jié)果表明，選用橙皮苷為定量檢測(cè)指標(biāo)以及建立的色譜條件進(jìn)行測(cè)定時(shí)，方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，可作為活血應(yīng)痛丸的質(zhì)量控制方法之一。

[1] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典(一部) [M]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 呂貽勝. HPLC 法測(cè)定陳皮中橙皮苷含量[J]. 安徽醫(yī)藥，2007，11(9):796 -797.