甘草中異甘草素和甘草素含量測定方法研究＊

周婭靜，常 靖，石海燕，王 青，馬雪梅

(中北大學化工與環(huán)境學院，山西 太原 030051)

甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch 具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥等功效[l-2]，主要化學成分包括三萜皂苷類、黃酮類及多糖類化合物三大類。黃酮類是甘草中最重要的活性物質[3-5]，具有明顯抗腫瘤、抗?jié)儭⒖寡住⒖拱滩〉茸饔肹6-7]。甘草素(liquiritigenin)是存在于甘草中的二氫黃酮單體化合物，具有抗癌、抗?jié)儭⒖寡住⒈８蔚壬砉π8]。異甘草素(isoliquiritigenin)是存在于甘草中的查爾酮單體化合物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用，還對哮喘病、糖尿病及艾滋病等疾病也有較強的藥理作用[9-10]。筆者采用高效液相色譜-紫外分光光度(HPLC-UV)波長轉換法對甘草中甘草素和異甘草素進行含量測定，此方法可用于甘草藥材的質量評價，同時可為其他藥材中有效成分的測定和提取提供參考。

1 儀器與試藥

大連依利特230 系列高效液相色譜儀(UV 230+紫外-可見檢測器、P230 高壓恒流泵、LU 230 低壓梯度混合器、7725i 手動進樣閥)。異甘草素對照品(批號為20100603)、甘草素對照品(批號為MUST-12022207)均來自西安開來生物工程有限公司，純度98%;甘草藥材2012 年10 月購自山西中醫(yī)學院，經(jīng)鑒定為甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch;甲醇(天津市申泰化學試劑有限公司，分析純)，超純水(自制)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Hyporsil ODS2 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇-水(45 ∶55)，等度洗脫;檢測波長:0 ～25 min 時為276 nm，25 ～70 min 時為360 nm;流速:0.8 mL/min;柱溫:室溫。對照品和供試品分離色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

稱取甘草素對照品1.6 mg 及異甘草素對照品0.7 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇制成每1 mL 分別含0.028 mg異甘草素和0.064 mg 甘草素的混合溶液，即得對照品溶液。取甘草藥材粉碎(過60 目篩)約0.5g，精密稱定，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，即得供試品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學考察

線性關系考察:精密吸取2，4，6，8，10 μL 甘草素和異甘草素的混合對照品溶液，以峰面積(X)為橫坐標、各對照品進樣量(Y)為縱坐標繪制標準曲線，并計算回歸方程。異甘草素的回歸方程為 Y=0.004 5 X-1.144 7，R2=0.999 6，進樣量線性范圍為0.028 ～0.28 μg。甘草素的回歸方程為Y=0.004 8 X-0.773 7，R2=0.999 1，進樣量線性范圍為0.064 ～0.64 μg。

精密度試驗:取同一對照品溶液，連續(xù)進樣5 次。結果異甘草素的峰面積一致，RSD 為1.8%;甘草素的峰面積一致，RSD 為2.7%，均小于3%。

重復性試驗:取同一批甘草藥材5 份各0.5 g，依法制成供試品溶液，進樣測定。結果異甘草素的RSD 為1.63%，甘草素的RSD 為2.16%，表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗:分別取2.2 項下方法制得的同一供試品溶液，于0，2，4，6，8，10 h 時重復進樣6 次，測定含量。結果3 個樣品中甘草素和異甘草素含量的RSD 分別為1.54%，1.81%，1.62%和1.72%，1.83%，2.01%，表明供試品溶液在10 h 內穩(wěn)定。

加樣回收試驗:分別取異甘草素和甘草素對照品適量，加入到已知含量的甘草藥材粉末中，按照2.2 項下方法制備供試品溶液依法測定含量，計算回收率。結果見表1。

2.4 樣品含量測定

取2.2 項下方法制備的供試品溶液3 份，按擬訂色譜條件進樣，每種供試品溶液重復進樣3 次，計算其平均值，然后根據(jù)標準曲線來計算含量。結果3 種樣品中甘草素含量依次為0.31，0.34，0.32，異甘草素含量依次為0.24%，0.25%，0.27%。

3 討論

在對甘草中的異甘草素和甘草素進行提取時，分別研究了不同的提取方法。控制提取時間為40 min，以甲醇作為提取溶劑，進行熱回流提取;以甲醇作為提取溶劑，室溫浸泡、濃縮得提取物;在超聲輔助下，用不同極性的甲醇(45%，70%，80%，100%)作為提取溶劑，得提取物。這些提取物都進行了2 種成分的含量測定。結果顯示，超聲輔助下80%甲醇的提取效果最好。

表1 異甘草素和甘草素加樣回收試驗結果( n=9)

試驗比較了以甲醇-水、甲醇-醋酸-水、乙腈-水作為流動相進行等度洗脫。這些不同的流動相系統(tǒng)對2 種成分的分離效果相差不大。同時發(fā)現(xiàn)，當以甲醇-醋酸-水系統(tǒng)作流動相時，甘草素的峰形對稱性明顯變好，分離度有所增大，但此系統(tǒng)不利于異甘草素的分離，使異甘素的峰高明顯降低，不利于分析。綜合考慮到普遍適用性，試驗選擇毒性較小的甲醇-水作為流動相。試驗還比較了不同比例甲醇-水作流動相時對甘草素和異甘草素的分離效果，結果表明，甲醇-水(45 ∶55)具有分離效果好、靈敏度高、檢測時間短等優(yōu)勢。

試驗采用了0.6，0.8，1.0 mL/min 3 個不同的流速，以比較系統(tǒng)不同流速對異甘草素和甘草素的分離效果。結果表明，流動相流速為0.6 mL/min 時，異甘草素的重現(xiàn)性較差;流速為1 mL/min時，甘草素與提取物中其他的雜質不能很好分離，分離度達不到分析要求。綜合考慮，選擇0.8 mL/min 為最佳流速。

對異甘草素和甘草素對照品溶液在200 ～800 nm 波長范圍內掃描。甘草素在213 nm 波長處有最大吸收，考慮到甲醇的截止波長，本試驗選擇了276 nm 波長作為甘草素的檢測波長，以避免流動相對分析結果的影響;異甘草素則選擇了其最大吸收波長360 nm 作為檢測波長，同時在該波長上可以避免一些雜質峰的干擾。甘草素和異甘草素都是甘草中的活性成分，建立波長切換HPLC 法同時測定了不同甘草提取物中兩者含量，方法簡便、快捷、重現(xiàn)性好，在對甘草活性成分的測定上有一定的創(chuàng)新性，可為科學全面評價地甘草提供試驗依據(jù)。

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