(-)表沒食子兒茶素沒食子酸酯對自然衰老大鼠模型學習記憶障礙的改善作用

邢曉東

(遼寧工業大學醫院，遼寧 錦州121001)

阿爾茨海默病(AD)是一個漸進性神經系統退行性疾病，已成為繼心血管疾病、癌癥、中風之后的第四大死亡原因。其最典型的病理性改變是的神經細胞間出現大量以β-淀粉樣肽為核心的老年斑、神經元的胞體中出現神經原纖維纏結及神經元丟失和膠質增生等。AD的發病機制目前尚未完全闡明，但自由基損傷學說和細胞凋亡學說備受人們的關注。自由基形成和氧化應激增強，進一步引起神經細胞凋亡，是導致AD的功能退化和神經變性的基礎。AD模型鼠腦中MDA水平較對照組顯著升高，高水平的MDA表達經常與神經元纖維纏結及老年斑相伴隨出現。并且臨床研究表明，阿爾茨海默病患者血清中SOD和GSH-Px活性明顯降低，而這兩種酶是人體內在抗氧化方面有著重要作用。(-)表沒食子兒茶素沒食子酸酯是綠茶的一種主要多酚成分，許多研究已經揭示了EGCG的生物活性與其抗氧化特性緊密相關。為探討觀察綠茶提取物(-)表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對自然衰老大鼠模型學習記憶障礙的改善作用，并初步探討其作用機制，本實驗選用22～24月齡SD大鼠，應用自然衰老大鼠篩選法制作AD模型，以EGCG灌胃給藥進行治療，利用行為學實驗及化學比色法觀察EGCG對衰老AD鼠的治療作用，并進一步探討其抗氧化的作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設備

TU-1810紫外可見分光光度計為北京普析通用儀器有限責任公司產品；Morris水迷宮裝置購自北京碩林苑生物科技有限公司；生物研究顯微鏡購自日本尼康科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

EGCG，純度＞95%，購自 Sigma公司；超敏 SP濃縮(鼠/兔)試劑盒，產品編號KIT-0310，購自北京中杉金橋有限公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)，產品編號ZB-2301，購自北京中杉金橋有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）、丙二醛（MDA）含量測定試劑盒均購自南京建成生物試劑有限公司。

1.1.3 實驗動物模型的分組及給藥

將造模成功的AD大鼠按各鼠平均逃避潛伏期的長短排序，根據隨機數字表隨機分為：模型組、EGCG治療組，每組11只，共2組；將5～6個月青年大鼠根據隨機數字表隨機抽取11只，作為對照組。水迷宮測試結束后即開始對入組動物進行灌胃給藥，EGCE治療組按照2mg/Kg.d的劑量灌胃給予EGCG；模型組和對照組給予等量蒸餾水灌胃。各組每天給藥1次，連續給藥30天

1.2 行為學觀察

水迷宮試驗：

參照Morris方法進行。從灌胃第24天進行水迷宮實驗，實驗訓練階段連續進行2天，每天訓練2次。第24天開始記錄數據，標記為數據表中的第1天，共4天。

1.3 海馬內SOD、GSH-Px酶活性及MDA含量的測定

行為學實驗結束后，將各組大鼠每組取6只，斷頭處死，冰上快速取海馬，入液氮及-80℃中凍存。檢測時將海馬加入預冷的生理鹽水制成10%的腦勻漿，2000rpm/min離心10min，取上清。腦組織SOD、GSH-PX活性及MDA含量的測定，具體操作均按試劑盒說明進行。

1.4 統計學處理

應用spss16.0版本軟件包統計軟件，進行數據統計分析。數據以均值加減標準差（）表示。組間比較采用方差分析采用ANOVA、Mauchy's Test of Sphercity、LSD's post hoc test進行統計學分析，以P<0.05表示有顯著性差異。

2 結果分析

在定位巡航試驗中，模型組大鼠的尋找平臺的潛伏期較對照組大鼠明顯延長(P<0.01)，而EGCG組大鼠的尋找潛伏期與模型組大鼠比明顯縮短(P<0.01)；在空間探索實驗中，模型組大鼠的尋找原平臺的潛伏期較對照組大鼠明顯延長(P<0.05)，而EGCG組大鼠的尋找潛伏期與模型組大鼠比明顯縮短(P<0.01)，而在目的象限的停留時間這一指標上，模型組大鼠在平臺所在象限的的時間較對照組大鼠明顯縮短(P<0.01)，而EGCG組大鼠在目的象限的時間與模型組大鼠比明顯延長(P<0.05)；就在目的象限逗留的百分率而言，模型組大鼠在目的象限逗留的百分率較空白對照組大鼠明顯縮短(P<0.05)，而EGCG組大鼠在目的象限逗留的時間百分率與模型組大鼠比明顯延長(P<0.01)。表明模型組大鼠的學習記憶及判斷能力下降，而EGCG改善了AD衰老模型鼠的學習記憶障礙。

3 討論

理想的動物模型的建立是研究AD的基礎。迄今為止，建立AD動物模型的方法很多，其中AD自然衰老模型鼠國外一些實驗室廣泛用于衰老和AD發病機制及藥物開發的研究。AD是一種年齡相關疾病，衰老因素在AD發病過程中扮演著重要角色，衰老所特有的病理生理變化及其它病變的影響，是用年輕動物制作的動物模型所不能替代的，選擇帶有認知和記憶嚴重缺失的個體，其病理行為表現與老年人和AD患者的認知損害相類似，同時還可出現某些相應的腦組織病理改變。該模型的特點是自然衰老，其神經系統的損害亦屬自然發生。由于AD的發病機制未明，目前所用的藥物造模和基因敲除造模方法制造的AD模型不能完全代表AD疾病的所有特點，而自然衰老的大鼠是通過一定標準的篩選制造的模型，就如同自然發病的AD患者，能夠較全面的代表AD疾病的特點。而且AD本身是一種老年疾病，目前藥物造模或基因敲除的老鼠多為青壯年，在神經系統、行為認知方面也許可以模擬AD的特點，但是從總體研究的角度來說，不如自然衰老模型的大鼠更具有代表性?？傊珹D衰老模型鼠模型成功的模擬了AD的行為學及病理學改變，可用于AD的藥物治療研究。

(-)表沒食子兒茶素沒食子酸酯是綠茶的一種主要多酚成分，研究證實綠茶有效的鐵螯和、抗氧化、抗炎、抗癌及神經保護等作用的發揮主要依賴于EGCG通過研究人大鼠成纖維細胞瘤PC12細胞，發現EGCG使產生非淀粉樣變性的可溶性APP(sAPP)的表達水平提高，延緩衰老大鼠自由基氧化損傷。由此提示了EGCG對神經細胞具有一定的保護作用。本實驗證實了EGCG對AD衰老模型大鼠氧化應激損傷的保護作用。

本研究結果表明，EGCG能夠明顯改善自然衰老大鼠的認知功能，提高大腦內的SOD、GSH-Px活性和減少了MDA的含量，證實EGCG主要的神經保護作用機制與其抗氧化作用有關，至于其他相關的作用機制，仍有待于作進一步的研究探討。