四種樟屬植物POD、EST同工酶電泳分析

陳鵬，練濤，杜永華，魏琴，伍自力

（宜賓學(xué)院香料植物資源開(kāi)發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644007）

四種樟屬植物POD、EST同工酶電泳分析

陳鵬，練濤，杜永華，魏琴，伍自力

（宜賓學(xué)院香料植物資源開(kāi)發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644007）

通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對(duì)香樟、油樟、大葉樟、天竺桂四種樟屬植物過(guò)氧化物同工酶（POD）、酯酶（EST）進(jìn)行分析.電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，香樟、油樟、大葉樟、天竺桂的POD同工酶各有4、4、3、6條條帶，EST同工酶各有4、3、3、3條條帶，四種植物的POD、EST同工酶酶譜之間存在共性和差異性.共性條帶（POD的P4和EST的P1）體現(xiàn)了同為樟屬植物的特征，差異性條帶體現(xiàn)了物種特異性和種間的親緣關(guān)系.大葉樟與天竺桂酶譜差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，香樟與油樟酶譜差異較小，親緣關(guān)系較近.這與形態(tài)方面的分類相一致.

樟屬;過(guò)氧化物同工酶;酯酶

油樟（Cinnamomum longepaniculatum(Gamble) N.Chao ex H.W.Li）、香樟（Cinnamomum camphora (L.)Presl）、大葉樟（Cinnamomum septentrionale Hand.-Mazz.）、天竺桂（Cinnamomum septentrionale Hand.-Mazz.）是樟科樟屬重要經(jīng)濟(jì)植物，其提取物在香料、醫(yī)藥、化工、食品及國(guó)防工業(yè)有廣泛應(yīng)用[1-6].這些樟屬植物還是重要的園林觀賞樹種，具有重要的生態(tài)地位[7-9].很多樟屬植物形態(tài)差異不大，特別是在幼苗時(shí)期其種子等僅從形態(tài)差異是難以區(qū)分的，為林業(yè)種苗的識(shí)別帶來(lái)了一定的麻煩.同工酶普遍存在于生物界，包括脊椎動(dòng)物、昆蟲、植物以及單細(xì)胞生物，是催化反應(yīng)相同而結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)不同的一組酶[10].其涉及酶的種類也很多，他們的存在與生物的代謝、細(xì)胞的分化、胚胎的發(fā)育和形態(tài)建成等都有密切的關(guān)系.同工酶電泳圖譜譜帶發(fā)生多態(tài)性變化，反映了生物在蛋白質(zhì)水平上的多型性，是生物發(fā)生遺傳分化的證據(jù)[11].同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，不同的組織其同工酶的表達(dá)也是不同的，同工酶酶譜在一定程度上反映了生物的系統(tǒng)發(fā)生.因此，利用同工酶分析技術(shù),從分子水平從遺傳背景方面來(lái)尋找植物種類間的親緣關(guān)系，在一定程度上彌補(bǔ)形態(tài)分類的不足.目前國(guó)內(nèi)樟科植物同工酶分析僅見(jiàn)毛豹皮樟[12]，而對(duì)本實(shí)驗(yàn)涉及的四種樟屬植物同工酶分析未見(jiàn)報(bào)道.為了更好地了解油樟、香樟、大葉樟、天竺桂四種樟屬植物分類及親緣關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)利用SDS-PAGE對(duì)四種樟屬植物過(guò)氧化物同工酶（POD）和酯酶(EST)同工酶進(jìn)行分析，為樟屬的分類鑒定提供生化依據(jù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

四種樟屬植物一年生嫩葉采自校園內(nèi)，分別編號(hào)為香樟（A1）、油樟（A2）、大葉樟（A3）、天竺桂(A4)，在4℃冰箱下低溫保存，備用.

1.2 方法

1.2.1 酶液制備

取香樟、油樟、大葉樟、天竺桂嫩葉各0.5 g，加入1mL提樣緩沖液(0.1mol/L Tris-HCl pH=8.0)、少許石英砂，置冰浴研磨后，8 000 r/min離心5min，上清液即為酶粗提液，取上清液保存于-20℃冰箱備用.

1.2.2SDS-PAGE

采用SDS-PAGE的方法，分離膠的濃度為7.5%，分離膠緩沖液為pH8.9的Tris-HCL溶液；濃縮膠濃度為3%，濃縮膠緩沖液為pH6.7的Tris-HCL溶液；電極緩沖液為pH8.3的Tris-Gly溶液.

1.2.3 電泳

從-20℃冰箱中取出樣品，4℃下解凍，取30mL初酶液，加入10mL 0.005%溴酚藍(lán)，再加入3～5滴甘油，制成電泳樣品.樣品點(diǎn)樣量為30mL，在4℃的冰箱中，先120 V恒壓電泳1 h，然后200 V電泳2 h,待酚藍(lán)走到距凝膠末端1 cm處時(shí)，停止電泳.

1.2.4 染色

POD采用醋酸－聯(lián)苯胺法染色[13]，聯(lián)苯胺染色液：稱取聯(lián)苯胺1 g，冰醋酸18mL，加水2mL，配成聯(lián)苯胺母液，然后量取0.5mL聯(lián)苯胺母液，0.2mL 3%H2O2，加蒸餾水9.3mL，配成染色液.常溫下染色5～10min，水沖洗，3%的醋酸固定，拍照.EST同工酶染色[14]，取100mg堅(jiān)牢藍(lán)RR鹽溶于4mL 1g/ 100mL丙酮-β-乙酸萘脂和4mL 1g/100mL丙酮-α-萘乙酸中，在染色前約1min加入150mL 1.0moL/ L磷酸鉀緩沖液（pH6.0），配成酯酶染色液.室溫下染色30～45min，取出膠板用蒸餾水漂洗后用7%的醋酸固定，拍照.

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)對(duì)POD、EST兩種同工酶的酶帶條數(shù)分析，計(jì)算出不同酶的Rf值及相似系數(shù)C.計(jì)算方法為：

式中n1為A材料酶譜的譜帶數(shù)，n2為B材料酶譜的譜帶數(shù)，n為A、B中相同的酶帶數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 POD同工酶酶譜分析

四種樟屬植物過(guò)氧化物同工酶電泳結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2.四種植物共電泳出8條酶帶，分別是P1、P2…P8.A1電泳出4條酶帶P1、P3、P5、P6，一條深帶P4，兩條淺帶P1、P3，一條最淺帶P5.A2有四條帶，三條深帶P1、P3、P4和一條淺帶P6.A3有三條淺帶P4、P5、P8.A4有六條帶三條深帶P1、P2、P3，三條淺帶P4、P6、P7.條數(shù)最多的是A4有六條酶帶，酶帶條數(shù)最少的是A3有三條淺的酶帶，其中P4（Rf=0.67）是四種植物的共同酶帶，P1（Rf=0.47）和P3(Rf=0.62)是A1、A2、A4的共同酶帶.種間差異較大的是P2、P7、P8這三條酶帶，是該植物的特征酶帶.四種植物的POD同工酶酶譜均存在差異，表明POD同工酶的種類專一性.

圖1 四種樟科植物POD同工酶電泳圖譜Fig.1 Four kindsof lauraceae plants POD electrophoresis

圖2 四種樟科植物POD電泳模式圖Fig.2 Four lauraceae plants POD isozyme pattern

2.2 EST同工酶酶譜分析

四種植物EST同工酶酶譜帶及其模式圖如圖3和圖4所示.從圖3、圖4可以看出，四種材料間酯酶同工酶之間的差異，呈現(xiàn)多態(tài)性，共電泳出6條酶帶，A1有四條帶，三條深帶P1、P4、P5，一條淺帶P6. A2有三條帶，兩條深帶P1、P5，一條淺帶P5.A3有三條帶，一條深帶P5，一條淺帶P1及一條最淺帶P2. A4三條帶，兩條深帶P1、P5，一條淺帶P3.其中A1酶帶條數(shù)最多有4條，其余均為三條.P1（Rf= 0.47）、P4(Rf=0.61)為四種材料的共同酶帶，而P2（Rf=0.53）、P3（Rf=0.58）、P6（Rf=0.76）這三條酶帶分別為材料A3、A4、A1的特征酶帶.在A1材料中有三條深帶及一條淺帶，A2、A4材料中均有兩條深帶及一條淺帶，A3中有一條深帶、一條淺帶及一條最淺帶.各種材料酯酶同工酶的酶譜特征各有差異.

圖3 四種樟科植物EST電泳圖譜Fig.3 Fourkinds of lauraceae plants ESTelectrophoresis

圖4 四種樟科植物EST電泳模式圖Fig.4 Fourkindsof lauraceae plants EST isozyme pattern

2.3 相似系數(shù)計(jì)算和親緣分析

四種樟屬植物之間的相似系數(shù)見(jiàn)表1.相似系數(shù)越大，遺傳距離越小，說(shuō)明種質(zhì)資源的親緣較近；相反，種質(zhì)資源的親緣較遠(yuǎn)[15].從表1可以看出四種植物間的相似系數(shù)在0.22～0.67之間，A1和A2之間的相似系數(shù)較大說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系較近，而A3和A4及A2和A3之間相似系數(shù)較小說(shuō)明它們之間的親緣較遠(yuǎn).

表1 樟科四種植物之間的相似系數(shù)Table 1 Lauraceae similarity coefficientbetween the four kindsofplants

3 討論

POD、EST同工酶酶譜表明，四種樟屬植物同工酶酶譜具有一些共有帶，但酶帶數(shù)量與活性強(qiáng)度有差異，此可作為四種樟屬植物種源鑒定的生化指標(biāo)之一.除用同工酶電泳的方法來(lái)種間關(guān)系及種的鑒定外，分子標(biāo)記也被運(yùn)用于遺傳資源及親緣關(guān)系的研究，如RFLP、RAPD、ISSR、SSA等[16-18].但對(duì)樟屬植物的分子標(biāo)記分析來(lái)研究種間關(guān)系卻報(bào)道較少，僅見(jiàn)香樟的分子標(biāo)記和遺傳分析[19-20].

通過(guò)對(duì)POD同工酶研究表明，香樟、油樟、大葉樟、天竺桂各有4、4、3、6條條帶，而EST同工酶有4、3、3、3條條帶，且在酶帶數(shù)量及深淺方面均存在差異.從POD同工酶研究四種材料間的親緣關(guān)系表明，香樟與油樟酶譜差異較小，親緣關(guān)系較近；大葉樟與天竺桂酶譜差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn).這為進(jìn)一步了解這幾種植物進(jìn)化關(guān)系提供參考.

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【編校：王露】

Peroxidase Isozyme and Esterase Isozyme Analysis on Four Lauraceae Plants

CHENPeng,LIAN Tao,DUYonghua,WEIQin,WU Zili
(Key Laboratory ofAromatic Plant Resources Exploitation and Utilization in Sichuan Higher Education Institution,Yibin University,Yibin,Sichuan 644007,China)

The relative relationships of different varietieswere defined by the comparison and analysis of isozyme zymograms.The reference for the aspectsof classification,varietiesappraisaland genetic breeding of Lauraceae plantswere offered.With themethod of polyacrylamide gel electronphoresis,peroxidase isozyme and esterase isozyme of four plant in genus of Lauraceae were observed and analyzed.The POD and EST electrophoresis testof four kinds of Lauraceae plants show that POD isozyme of Cinnamomum camphora(L.)Presl,Cinnamomum longepaniculatum(Gamble)N.Chao ex H. W.Li,Cinnamomum septentrionale Hand.-Mazz.,and Cinnamomum septentrionale Hand.-Mazz.each contain 4,4,3,6 bands,and EST isozyme research shows that there are 4,3,3,3 bands respectively.POD and EST isozyme zymogram differences of these four plants indicate that the types of POD and EST isozyme bear specificity.The enzyme of POD isozyme and EST isozyme of the four plants differs in depth,etc.,indicating that despite some common bands in POD and EST isozyme zymogram,the number and enzyme activity intensity have differences;The difference in enzyme zymogram between Cinnamomum septentrionale Hand.-Mazz.and Cinnamomum septentrionale Hand.-Mazz,is significantand have a distant relationship.The difference in enzyme zymogramb between Cinnamomum longepaniculatum(Gamble)N.Chao ex H.W.Liand Cinnamomum camphora(L.)Presl issmall,and have closer relationship.This is consistentwith the traditionalmorphological classification.

Lauraceae;peroidase isozyme;esterase isozyme

Q946.5

A

1671-5365(2014)12-0033-03

2014-05-20修回：2014-07-01

四川省教育廳項(xiàng)目（08ZA002）；四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010JY0093）；四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2011JTD0035）；宜賓市科技局項(xiàng)目（2011ZSF008）

陳鵬（1990-），男，本科生，生物科學(xué)專業(yè)

魏琴（1967-），女，教授，博士，研究方向?yàn)橘Y源植物學(xué)

時(shí)間：2014-09-12 13:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1630.Z.20140912.1300.003.htm l