蘿卜下胚軸高效再生體系的建立

李媛媛　王冰林　韓佳　鄭慧敏　何珊　胡玉榮　張軍

摘要：以7個(gè)蘿卜品種為試材，開展下胚軸離體培養(yǎng)研究，通過基因型篩選確定具有較高再生頻率的蘿卜品種進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，探討AgNO3濃度、激素配比、瓊脂濃度等因素對(duì)蘿卜下胚軸再生的影響。結(jié)果表明：蘿卜下胚軸再生的最適培養(yǎng)基為改良MS+1.8 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA+5 mg/L AgNO3+0.9%瓊脂+30 g/L 蔗糖，不定芽再生率高達(dá)78.3%，玻璃化率僅為2.8%。

關(guān)鍵詞：蘿卜；下胚軸；離體再生；AgNO3；激素配比

中圖分類號(hào)： S631.104.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0058-03

收稿日期：2013-05-16

基金項(xiàng)目：山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金（編號(hào)：2007BS06024）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程重大課題。

作者簡(jiǎn)介：李媛媛（1979—），女，山東桓臺(tái)人，博士，講師，從事蔬菜遺傳育種研究。Tel：（0536）8785690；E-mail：yylilove@126.com。

通信作者：王冰林，博士，副研究員，從事蔬菜遺傳育種與栽培生理研究。Tel：（0536）2118661；E-mail：binglinwang@126.com。蘿卜是一種重要的營(yíng)養(yǎng)保健蔬菜，在我國(guó)蔬菜栽培和供應(yīng)中占有重要地位，近幾年種植面積不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量也在逐步提高，目前全國(guó)蘿卜栽培面積約為120萬hm2/年，總產(chǎn)量達(dá) 2 683萬t/年[1]。蘿卜生產(chǎn)以應(yīng)用雜交種為主，自交不親和系和雄性不育系利用是蘿卜雜交育種的重要途徑，而其傳統(tǒng)的保存方法局限性較大。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，組織培養(yǎng)成為保存和快繁自交不親和系和雄性不育系的有效途徑，同時(shí)也是利用基因工程技術(shù)選育優(yōu)良品種的重要前提。蘿卜為再生頑拗型植物，再生頻率普遍較低[2]，所以建立高效、實(shí)用的離體再生體系和組培快繁體系成為蘿卜生物技術(shù)育種的關(guān)鍵限制因素。因此，筆者選用7個(gè)蘿卜品種，從基因型、激素配比、AgNO3濃度、瓊脂濃度等方面對(duì)蘿卜下胚軸再生的影響進(jìn)行了研究，旨在建立高效的蘿卜離體再生體系，為利用生物技術(shù)與常規(guī)育種方法相結(jié)合開展蘿卜遺傳育種和良種繁育提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試7個(gè)蘿卜品種由山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，分別為雜交種紅光102、白玉冠軍、濰蘿卜1號(hào)、濰蘿卜2號(hào)、濰蘿卜3號(hào)，常規(guī)種濰縣蘿卜、改良濰縣蘿卜。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1無菌苗培養(yǎng)挑選顆粒飽滿的蘿卜種子，用蒸餾水清洗干凈后用濾紙吸干。在超凈工作臺(tái)上用70%乙醇處理 30 s，再用0.1%氯化汞處理8 min，無菌水沖洗4～5遍，然后接種于1/2MS培養(yǎng)基（含20 g/L 蔗糖+7.5 g/L 瓊脂，pH值 5.8～6.0）上。每個(gè)三角瓶接種5～10粒種子，置于25 ℃、光照時(shí)間16 h/d、光照強(qiáng)度2 000 lx條件下培養(yǎng)，獲得無菌苗。

1.2.2不定芽誘導(dǎo)切取生長(zhǎng)4～5 d的無菌苗下胚軸（切段長(zhǎng)5～10 mm），接種于改良培養(yǎng)基（MS+5 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA+7.5 g/L 瓊脂+30 g/L 蔗糖）上，每瓶接種 4～5個(gè)外植體。在溫度25 ℃、光照時(shí)間16 h/d、光照強(qiáng)度 2 000 lx 條件下培養(yǎng)15～20 d，統(tǒng)計(jì)不定芽再生率及玻璃化率，選出再生頻率較高的蘿卜基因型。以再生情況最好的基因型為材料，篩選合適的激素（6-BA和NAA）濃度配比、AgNO3 濃度和瓊脂濃度。愈傷再生率=（形成愈傷的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)）×100%；愈傷褐化率=（褐化的愈傷數(shù)/愈傷總數(shù)）×100%；不定芽再生率=（形成再生芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)）×100%；玻璃化率=（玻璃化芽數(shù)/芽總數(shù)）×100%。

1.2.3不定根誘導(dǎo)外植體培養(yǎng)15～20 d后，愈傷組織基本脫分化出不定芽，將不定芽切割成小塊，接于1/2MS基本培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。

2結(jié)果與分析

2.1不同基因型對(duì)蘿卜下胚軸再生的影響

在改良培養(yǎng)基（MS+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+7.5 g/L 瓊脂+30 g/L 蔗糖）上培養(yǎng)5 d左右，蘿卜下胚軸兩端開始膨大，10 d左右形成明顯的愈傷組織，15 d左右長(zhǎng)出不定芽。在供試的7個(gè)蘿卜品種中，改良濰縣蘿卜不定芽再生率最高，達(dá)48.2%，其次為濰蘿卜3號(hào)，其他品種不定芽再生率較低，且愈傷褐化率、玻璃化率偏高；白玉冠軍雖然愈傷再生率最高，但未長(zhǎng)出不定芽（表1），所以選擇改良濰縣蘿卜為試材進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，圖1為該品種下胚軸離體培養(yǎng)各階段的生長(zhǎng)狀況。

2.2不同AgNO3濃度對(duì)蘿卜下胚軸再生的影響

由表2可知，在培養(yǎng)基中添加AgNO3可提高改良濰縣蘿卜品種下胚軸愈傷再生率和不定芽再生率，而降低愈傷褐化率和玻璃化率，且隨著濃度增加，變化幅度加大。鑒于AgNO3對(duì)植物生長(zhǎng)具有毒害作用，濃度過高會(huì)抑制蘿卜不定芽生長(zhǎng)，宜選擇5 mg/L。

3結(jié)論與討論

蘿卜是再生頑拗型植物，基因型對(duì)蘿卜再生能力影響較大[3-5]。在本研究所用的7個(gè)蘿卜品種中，改良濰縣蘿卜下胚軸再生率達(dá)到48.2%，而白玉冠軍下胚軸再生率為0，品種間存在較大差異。王洋等認(rèn)為，對(duì)于具有高頻再生潛力的基因型，通過改良培養(yǎng)基能夠建立一個(gè)高頻再生體系[6]。所以，改良濰縣蘿卜可作為下胚軸再生的較理想基因型。

關(guān)于蘿卜離體再生的研究較少，主要以子葉和下胚軸為外植體。徐文玲等以蘿卜帶柄子葉為外植體，建立了再生率較高的再生體系[2，7-8]。在早期，崔群香等對(duì)蘿卜下胚軸離體再生進(jìn)行了初步探討，但對(duì)離體再生的影響因素及不定芽再生率缺乏系統(tǒng)研究[9-10]。王輝等將誘導(dǎo)出的45塊愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，僅分化出3個(gè)芽，再生率很低[11]。本研究以再生頻率較高的改良濰縣蘿卜品種為試材，系統(tǒng)研究了AgNO3濃度、激素配比、瓊脂濃度等因素對(duì)蘿卜下胚軸再生的影響，建立了蘿卜下胚軸愈傷誘導(dǎo)率100%、不定芽再生率78.3%、玻璃化率僅為2.8%的高效再生體系，其最適改良培養(yǎng)基為 MS+1.8 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA+5 mg/L AgNO3+ 9 g/L 瓊脂+30 g/L 蔗糖，這為利用生物技術(shù)進(jìn)行蘿卜育種和制種工作奠定了良好基礎(chǔ)。

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