培養基中不同因素對中華紅葉楊外植體褐變的影響

摘要：中華紅葉楊外植體在固體培養過程中褐變嚴重，因此針對培養基的pH值、無機鹽濃度、培養基硬度、蔗糖濃度及活性炭添加量進行試驗。結果表明：在一定pH值范圍（5.0～6.5）內，pH值越低，褐化率越低；無機鹽濃度低，褐化率低；在瓊脂濃度為5.0～6.5 g/L時，瓊脂濃度越高，培養基越硬，褐化率越低；低蔗糖濃度有利于降低褐化率；活性炭對褐化率的影響與添加量有關，適宜的添加量有利于降低褐化率。

關鍵詞：中華紅葉楊；外植體；褐變

中圖分類號： S792.110.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0044-02

收稿日期：2013-05-05

作者簡介：李樹麗（1974—），女，山東沾化人，講師，主要從事植物組織培養方面的教學與研究。E-mail：bzlishuli@163.com。楊樹是世界各國普遍栽培的樹種，其栽培歷史悠久。楊樹具有生長迅速、輪伐期短、適應性強、易繁殖等特點，各地廣泛用作行道樹、防護林及速生用材樹種。中華紅葉楊（Populus euramericana cv.Zhonghuahongye）是近幾年才發展起來的一個楊樹新品種，它不僅保持了楊樹的速生特性，而且其葉色隨季節呈現不同的變化，具有較高的觀賞性，是集觀賞與用材于一身的優良樹種，發展潛力巨大。應用組織培養方法實現植物離體快繁的突出優點是快速、遺傳背景均一、不受季節和地區等限制、重復性好，應用這種方法已實現了多種苗木的快速繁殖。但中華紅葉楊在組織培養過程中由于外植體的褐變影響了試管苗的分化及生長，因此本試驗就培養基中不同因素對中華紅葉楊外植體褐變的影響進行探索。

1材料與方法

1.1材料

中華紅葉楊：選自惠民紅葉楊發展公司的紅葉楊生產基地。外植體：選取中華紅葉楊一年生的枝條，將其切割成適當大小的莖段。

1.2儀器

電子分析天平，上海天平儀器廠生產；立式高壓蒸汽滅菌鍋，日本三洋公司生產；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司生產。

1.3試劑

鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇等均為國產分析純；pH試紙，上海三愛思試劑有限公司生產；精密pH計（PHS-3C型），上海雙贏科學儀器有限公司生產。

1.4方法

基本培養基：除特殊說明外，基本培養基為MS培養基，蔗糖濃度為30 g/L，瓊脂濃度為5.5 g/L，pH值為5.8。

1.4.1pH值對褐變的影響分別配制pH值為5.0、5.5、60、6.5的培養基（其他同基本培養基），每種pH值的培養基接種10瓶。接種后每5 d觀察1次。每處理重復3次。

1.4.2無機鹽濃度對褐變的影響設置3組處理，每組處理接種10瓶。接種后每5 d觀察1次。每處理重復3次。處理1：采用改良MS培養基（大量元素減半）；處理2：采用 1/2MS 培養基；處理3：采用MS培養基（對照）。

1.4.3培養基硬度對褐變的影響分別配制瓊脂含量為50、5.5、6.0、6.5 g/L的培養基（其他同基本培養基）每種培養基接種10瓶。接種后每5 d觀察1次。每處理重復3次。

1.4.4蔗糖濃度對褐變的影響分別配制蔗糖濃度為20%、2.5%、3.0%、4.0%的培養基（其他同基本培養基），每種培養基接種10瓶。接種后每5 d觀察1次。每處理重復3次。

1.4.5活性炭添加量對褐變的影響設置4組處理，每組處理接種10瓶。接種后每5 d觀察一次。4組處理分別重復3次。處理1：基本培養基，不添加活性炭（對照）；處理2：基本培養基，添加1 g/L的活性炭；處理3：基本培養基，添加3 g/L的活性炭；處理4：基本培養基，添加5 g/L的活性炭。

2結果與分析

2.1pH值對褐化率的影響

隨著培養時間的延長，不同pH值培養基上培養的外植體的褐化率都逐步提高。外植體的褐化率隨pH值變化也呈規律性的變化，在相同的觀察時間內，pH值越低，褐化率越低，隨著pH值的增加，褐化率也增加，不同處理之間差異顯著。說明不同的pH值對褐化率有明顯影響。從圖1可以看出，pH值5.0水平下的褐化率最低，說明低的pH值可以在一定程度上抑制褐變。

2.2無機鹽濃度對褐化率的影響

接種后5 d，改良MS培養基和1/2MS培養基上培養的外植體褐化率較低，而且水平相當；而MS培養基上培養的外植體褐化率較高。隨著培養時間延長，3種處理褐化率都逐步增加，其中，MS培養基上培養的外植體褐化率一直處于最高水平，改良MS培養基和1/2MS培養基上培養的外植體的褐化率在整個培養過程中水平相當，兩者與MS培養基（對照）間差異顯著（圖2），說明無機鹽濃度對褐化率有影響。

2.3培養基硬度對褐化率的影響

外植體的褐化率隨瓊脂濃度的增加呈現規律性的變化，瓊脂濃度越低，褐化率越高，隨瓊脂濃度的增加，褐化率逐漸

降低。不同處理之間差異顯著（圖3），說明培養基硬度對褐化率有顯著影響。雖然在一定范圍內瓊脂濃度越高，外植體的褐化率越低，但瓊脂濃度過高，會造成培養基過硬，在接種時，外植體較難插入，還容易造成培養基的裂縫和分塊現象，同時培養基過硬，培養基中的營養物質和激素難以運輸，影響外植體的生長。

2.4蔗糖濃度對褐化率的影響

在蔗糖濃度的處理試驗中，接種第5 d時，4種處理都出現了褐化現象，含2%蔗糖的培養基上培養的外植體褐化率最低；而含4%蔗糖的培養基上培養的外植體褐化率最高，兩者差異較大。隨著培養時間的延長，各組處理的褐化率都隨之增加，含2%蔗糖的培養基上培養的外植體的褐化率一直處于最低水平，而含4%蔗糖的培養基上培養的外植體的褐化率一直處于最高水平，不同處理之間差異顯著（圖4）。說明蔗糖濃度對褐化率影響較大，低的蔗糖濃度有利于抑制褐化。

2.5活性炭添加量對褐化率的影響

圖5顯示，培養基中加入活性炭后外植體的褐化率明顯低于培養基中不加活性炭的。培養基中活性炭添加量影響外植體的褐化率，培養基中加入1 g/L的活性炭，外植體的褐化率從不添加活性炭對照的76.7%降到40.0%；培養基中加入

3 g/L的活性炭，外植體的褐化率最低，為23.3%；而培養基中加入5 g/L的活性炭，外植體的褐化率反而增加。

3討論

3.1pH值對褐變的影響

pH值能影響外植體的褐變，在一定范圍內（pH值 5.0～6.5），pH值越高，褐化現象越嚴重，低的pH值能明顯地抑制褐變。其原因可能是培養基中低pH值可降低PPO活性和底物利用率，從而抑制褐變[1]。在水稻體細胞培養中，pH值為4.5～5.0時MS液體培養基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態，其表面呈黃白色，而pH值為55～6.0時，愈傷組織嚴重褐變[2]。

3.2無機鹽濃度對褐變的影響

無機鹽濃度影響外植體的褐化率，低的無機鹽濃度能減輕褐變現象，其原因可能是培養基中無機鹽濃度過高可引起酚類物質的大量產生，導致外植體褐變，降低鹽濃度則可減少酚類外溢，減輕褐變[1]。鄒英寧等在中國李的組織培養中也認為改良MS培養基的褐化率低于MS培養基[3]。張妙霞等在柿樹組織培養防止褐變所進行的試驗中，培養基以改良MS培養基（大量元素減半）和1/2MS培養基的效果最好，MS培養基的效果較差，表明低濃度的無機鹽可促進外植體生長與分化，減輕外植體褐變程度[4]。

3.3培養基硬度對褐變的影響

在一定范圍內（瓊脂5.0～ 65 g/L），瓊脂用量越大，培養基硬度越大，褐變越輕，這與金堅敏在水稻上的試驗結果[2]一致，其原因可能是培養基的硬度影響了酚類物質擴散速度的緣故。但培養基過硬，也影響外植體對營養物質和激素的吸收，造成外植體生長不良。

蔗糖濃度對褐變的影響：蔗糖濃度明顯地影響外植體的褐變，蔗糖濃度越高，褐化率越高，低的蔗糖濃度有利于減輕褐變。王苑等在植物組織培養的褐變現象及研究進展中指出過高的糖濃度會加劇褐變[5]。

活性炭對褐變的影響：培養基中加入一定量的活性炭能明顯地抑制褐變，因為活性炭能吸附外植體產生的有害物質，從而減輕褐變。曹鴻斌等在對龍眼外植體褐變的研究中也證實加入活性炭能較好地抑制褐化[6]。但活性炭加入的量要適宜，因為活性炭的吸附作用是無選擇性的，它在吸附有害物質的同時，也吸附了營養物質和激素，從而影響外植體生長。

除培養基外，影響外植體褐變的因素還有很多，如外植體的生理狀態、溫度、光照等，需要進一步研究探討。

參考文獻：

[1]劉慶昌，吳國良. 植物細胞組織培養[M]. 北京：中國農業大學出版社，2003：40.

[2]金堅敏，張靜蘭，唐定臺. 水稻幼穗和成熟種子誘導胚狀體時的有關因子探討[J]. 植物學通報，1992，9（2）：53-54.

[3]鄒英寧，李國懷，吳強盛.中國李組織培養過程中褐變的抑制研究[J]. 山地農業生物學報，2007，26（6）：508-512.

[4]張妙霞，孔祥生，郭秀璞，等. 柿樹組織培養防止外植體褐變的研究[J]. 河南農業大學學報，1999，33（1）：87-91.

[5]王苑，謝凝子. 植物組織培養中的褐變現象及抗褐變研究進展[J]. 黔西南民族師范高等專科學校學報，2007（3）：109-113.

[6]曹鴻斌，劉魁英，趙宗蕓，等. 龍眼組培的褐變抑制研究[J]. 安徽農業科學，2008，36（8）：3132-3133.駱美蓉，江明鋒，張鵬，等. 山羊分子生物學研究進展[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：46-49.

2.5活性炭添加量對褐化率的影響

圖5顯示，培養基中加入活性炭后外植體的褐化率明顯低于培養基中不加活性炭的。培養基中活性炭添加量影響外植體的褐化率，培養基中加入1 g/L的活性炭，外植體的褐化率從不添加活性炭對照的76.7%降到40.0%；培養基中加入

3 g/L的活性炭，外植體的褐化率最低，為23.3%；而培養基中加入5 g/L的活性炭，外植體的褐化率反而增加。

3討論

3.1pH值對褐變的影響

pH值能影響外植體的褐變，在一定范圍內（pH值 5.0～6.5），pH值越高，褐化現象越嚴重，低的pH值能明顯地抑制褐變。其原因可能是培養基中低pH值可降低PPO活性和底物利用率，從而抑制褐變[1]。在水稻體細胞培養中，pH值為4.5～5.0時MS液體培養基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態，其表面呈黃白色，而pH值為55～6.0時，愈傷組織嚴重褐變[2]。

3.2無機鹽濃度對褐變的影響

無機鹽濃度影響外植體的褐化率，低的無機鹽濃度能減輕褐變現象，其原因可能是培養基中無機鹽濃度過高可引起酚類物質的大量產生，導致外植體褐變，降低鹽濃度則可減少酚類外溢，減輕褐變[1]。鄒英寧等在中國李的組織培養中也認為改良MS培養基的褐化率低于MS培養基[3]。張妙霞等在柿樹組織培養防止褐變所進行的試驗中，培養基以改良MS培養基（大量元素減半）和1/2MS培養基的效果最好，MS培養基的效果較差，表明低濃度的無機鹽可促進外植體生長與分化，減輕外植體褐變程度[4]。

3.3培養基硬度對褐變的影響

在一定范圍內（瓊脂5.0～ 65 g/L），瓊脂用量越大，培養基硬度越大，褐變越輕，這與金堅敏在水稻上的試驗結果[2]一致，其原因可能是培養基的硬度影響了酚類物質擴散速度的緣故。但培養基過硬，也影響外植體對營養物質和激素的吸收，造成外植體生長不良。

蔗糖濃度對褐變的影響：蔗糖濃度明顯地影響外植體的褐變，蔗糖濃度越高，褐化率越高，低的蔗糖濃度有利于減輕褐變。王苑等在植物組織培養的褐變現象及研究進展中指出過高的糖濃度會加劇褐變[5]。

活性炭對褐變的影響：培養基中加入一定量的活性炭能明顯地抑制褐變，因為活性炭能吸附外植體產生的有害物質，從而減輕褐變。曹鴻斌等在對龍眼外植體褐變的研究中也證實加入活性炭能較好地抑制褐化[6]。但活性炭加入的量要適宜，因為活性炭的吸附作用是無選擇性的，它在吸附有害物質的同時，也吸附了營養物質和激素，從而影響外植體生長。

除培養基外，影響外植體褐變的因素還有很多，如外植體的生理狀態、溫度、光照等，需要進一步研究探討。

參考文獻：

[1]劉慶昌，吳國良. 植物細胞組織培養[M]. 北京：中國農業大學出版社，2003：40.

[2]金堅敏，張靜蘭，唐定臺. 水稻幼穗和成熟種子誘導胚狀體時的有關因子探討[J]. 植物學通報，1992，9（2）：53-54.

[3]鄒英寧，李國懷，吳強盛.中國李組織培養過程中褐變的抑制研究[J]. 山地農業生物學報，2007，26（6）：508-512.

[4]張妙霞，孔祥生，郭秀璞，等. 柿樹組織培養防止外植體褐變的研究[J]. 河南農業大學學報，1999，33（1）：87-91.

[5]王苑，謝凝子. 植物組織培養中的褐變現象及抗褐變研究進展[J]. 黔西南民族師范高等專科學校學報，2007（3）：109-113.

[6]曹鴻斌，劉魁英，趙宗蕓，等. 龍眼組培的褐變抑制研究[J]. 安徽農業科學，2008，36（8）：3132-3133.駱美蓉，江明鋒，張鵬，等. 山羊分子生物學研究進展[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：46-49.

2.5活性炭添加量對褐化率的影響

圖5顯示，培養基中加入活性炭后外植體的褐化率明顯低于培養基中不加活性炭的。培養基中活性炭添加量影響外植體的褐化率，培養基中加入1 g/L的活性炭，外植體的褐化率從不添加活性炭對照的76.7%降到40.0%；培養基中加入

3 g/L的活性炭，外植體的褐化率最低，為23.3%；而培養基中加入5 g/L的活性炭，外植體的褐化率反而增加。

3討論

3.1pH值對褐變的影響

pH值能影響外植體的褐變，在一定范圍內（pH值 5.0～6.5），pH值越高，褐化現象越嚴重，低的pH值能明顯地抑制褐變。其原因可能是培養基中低pH值可降低PPO活性和底物利用率，從而抑制褐變[1]。在水稻體細胞培養中，pH值為4.5～5.0時MS液體培養基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態，其表面呈黃白色，而pH值為55～6.0時，愈傷組織嚴重褐變[2]。

3.2無機鹽濃度對褐變的影響

無機鹽濃度影響外植體的褐化率，低的無機鹽濃度能減輕褐變現象，其原因可能是培養基中無機鹽濃度過高可引起酚類物質的大量產生，導致外植體褐變，降低鹽濃度則可減少酚類外溢，減輕褐變[1]。鄒英寧等在中國李的組織培養中也認為改良MS培養基的褐化率低于MS培養基[3]。張妙霞等在柿樹組織培養防止褐變所進行的試驗中，培養基以改良MS培養基（大量元素減半）和1/2MS培養基的效果最好，MS培養基的效果較差，表明低濃度的無機鹽可促進外植體生長與分化，減輕外植體褐變程度[4]。

3.3培養基硬度對褐變的影響

在一定范圍內（瓊脂5.0～ 65 g/L），瓊脂用量越大，培養基硬度越大，褐變越輕，這與金堅敏在水稻上的試驗結果[2]一致，其原因可能是培養基的硬度影響了酚類物質擴散速度的緣故。但培養基過硬，也影響外植體對營養物質和激素的吸收，造成外植體生長不良。

蔗糖濃度對褐變的影響：蔗糖濃度明顯地影響外植體的褐變，蔗糖濃度越高，褐化率越高，低的蔗糖濃度有利于減輕褐變。王苑等在植物組織培養的褐變現象及研究進展中指出過高的糖濃度會加劇褐變[5]。

活性炭對褐變的影響：培養基中加入一定量的活性炭能明顯地抑制褐變，因為活性炭能吸附外植體產生的有害物質，從而減輕褐變。曹鴻斌等在對龍眼外植體褐變的研究中也證實加入活性炭能較好地抑制褐化[6]。但活性炭加入的量要適宜，因為活性炭的吸附作用是無選擇性的，它在吸附有害物質的同時，也吸附了營養物質和激素，從而影響外植體生長。

除培養基外，影響外植體褐變的因素還有很多，如外植體的生理狀態、溫度、光照等，需要進一步研究探討。

參考文獻：

[1]劉慶昌，吳國良. 植物細胞組織培養[M]. 北京：中國農業大學出版社，2003：40.

[2]金堅敏，張靜蘭，唐定臺. 水稻幼穗和成熟種子誘導胚狀體時的有關因子探討[J]. 植物學通報，1992，9（2）：53-54.

[3]鄒英寧，李國懷，吳強盛.中國李組織培養過程中褐變的抑制研究[J]. 山地農業生物學報，2007，26（6）：508-512.

[4]張妙霞，孔祥生，郭秀璞，等. 柿樹組織培養防止外植體褐變的研究[J]. 河南農業大學學報，1999，33（1）：87-91.

[5]王苑，謝凝子. 植物組織培養中的褐變現象及抗褐變研究進展[J]. 黔西南民族師范高等專科學校學報，2007（3）：109-113.

[6]曹鴻斌，劉魁英，趙宗蕓，等. 龍眼組培的褐變抑制研究[J]. 安徽農業科學，2008，36（8）：3132-3133.駱美蓉，江明鋒，張鵬，等. 山羊分子生物學研究進展[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：46-49.