基于EST和GSS序列的木豆miRNA生物信息學(xué)分析

李崇奇　周鵬　蔡望偉

摘 要：應(yīng)用miRtour在線分析工具對木豆EST和GSS序列進(jìn)行miRNA生物信息學(xué)預(yù)測，應(yīng)用psRNATarget進(jìn)行靶基因預(yù)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，43條不同的木豆miRNA成熟序列，隸屬于33個(gè)不同的miRNA家族。靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)有36條編碼序列受miRNA調(diào)控，其中17條序列編碼酶，2條編碼轉(zhuǎn)錄因子，7條編碼參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白，5條編碼參與蛋白質(zhì)降解通路的蛋白。

關(guān)鍵詞：木豆；miRNA；EST；GSS

中圖分類號 Q74 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）10-17-04

Abstract：Cajanus cajan microRNA has been predicted based on EST and GSS Sequences by miRtour，whereas miRNA-targeted mRNAs has been predicted by psRNATarget. 43 unique mature miRNA sequences were found belonging to 33 different miRNA familes in Cajanus cajan. 36 coding RNAs were regulated by miRNA in which 17 targets were enzymes，2 targets were transcription factors，7 targets were protein involved in signaling transduction，5 targets were protein participated in protein degradation pathway.

Key words：Cajanus cajan；miRNA；EST；GSS

木豆（Cajanus cajan）俗稱大樹豆，為一年生或多年生灌木植物，耐瘠薄干旱，原產(chǎn)于印度，我國大約于1 500a前開始從印度引種栽培，現(xiàn)主要栽培于長江以南省份，種植面積超過20萬hm2[1]。木豆為世界第六大食用豆類，也是唯一的木本食用豆，此外還被廣泛用作動物飼料、造紙?jiān)稀⑺幱弥参锖妥夏z蟲寄主樹，也可作水土保持和土壤改良樹種[2]。miRNA是一類長度為19～24bp的內(nèi)源性小RNA分子，其主要通過與靶基因結(jié)合后在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控，由于其參與了植物器官的發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)和抗逆反應(yīng)等一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程[3]，因而近年來被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳品質(zhì)改良工作。本研究擬應(yīng)用miRtour在線分析工具（http：//bio2server.bioinfo.uni-plovdiv.bg/miRTour/）[4]對木豆的EST序列和GSS序列進(jìn)行分析，識別其miRNA基因和靶基因，為進(jìn)一步開展木豆分子遺傳育種工作奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 木豆的EST序列和GSS序列分別從美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov）的EST和GSS數(shù)據(jù)庫中下載，共得到25 576條EST序列和90 109條GSS序列。從rfam（http：//rfam.sanger.ac.uk/）網(wǎng)站和pfam（http：//pfam.sanger.ac.uk/）網(wǎng)站分別下載非編碼RNA數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法 將EST序列和GSS序列分批遞交到miRtour網(wǎng)站上傳后參數(shù)設(shè)置如下：與已知miRNA序列能夠比對的最小數(shù)量（Minimum number of known miRNAs to be aligned）設(shè)置為1，miRNA序列與其互補(bǔ)序列的不配對數(shù)（Maximum unpaired nt in miR/miR*）設(shè)置為6，其他參數(shù)默認(rèn)。下載分析結(jié)果可以得到相應(yīng)的miRNA序列、前體序列以及前體序列的最小自由能、最小自由能指數(shù)等相關(guān)參數(shù)。然后應(yīng)用blast-2.2.27+軟件中分別與rfam數(shù)據(jù)庫和pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，去除非miRNA序列，即可得到miRNA前體序列和相應(yīng)的miRNA序列。將預(yù)測到木豆miRNA序列和木豆EST序列上傳到psRNATarget網(wǎng)站（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/）[5]進(jìn)行靶基因預(yù)測。然而將預(yù)測的靶基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast分析，進(jìn)行靶基因注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA預(yù)測 經(jīng)過miRtour分析后共發(fā)現(xiàn)81條序列具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其可能為木豆miRNA前體序列。與rfam和pfam數(shù)據(jù)庫比對后沒有發(fā)現(xiàn)在這81條序列中存在除miRNA序列之外的編碼序列和非編碼序列。去除重復(fù)預(yù)測miRNA序列后，共預(yù)測到43條不同的木豆miRNA成熟序列（表1），其中只有cca-miR809a和cca-miR533是從EST序列預(yù)測的，其余均為從GSS序列預(yù)測。預(yù)測到的木豆miRNA序列隸屬于33個(gè)不同的miRNA家族，其中成員最多的為miR159家族，有4個(gè)成員。木豆miRNA長度為20～24nt，其中長度為21nt的miRNA最多，有30個(gè)。miRNA前體長度為90～222nt，平均長度為182nt。前體序列的最小自由能都為-15.79～-101.5kCal/mol，最小自由能指數(shù)為0.70～1.62，GC含量為11.71%～61.40%。

2.2 miRNA靶基因預(yù)測 43個(gè)木豆miRNA中有24個(gè)預(yù)測到了靶基因，預(yù)測到有90條EST序列代表的編碼序列受miRNA調(diào)控，但能夠被注釋的編碼序列有36條（表2）。靶基因中有17條序列編碼酶，主要包括參與蛋白質(zhì)分子折疊的UDP糖基轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞壁生成的纖維素合成酶和參與氧化還原反應(yīng)的開鏈馬錢子甙合酶等。此外靶基因中有2個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子，編碼核因子；7條編碼參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白，編碼鈣調(diào)蛋白、FAM10蛋白和STAT蛋白；5條編碼參與蛋白質(zhì)降解通路的蛋白，編碼泛素和SKP1類蛋白；其余5條編碼伸展蛋白、細(xì)胞色素C、分子伴侶和阿拉伯半乳聚糖肽。

3 結(jié)論與討論

EST序列，又稱表達(dá)序列標(biāo)簽，是從隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5′端和3′端單一次測序獲得的短的cDNA 部分序列。GSS序列，又稱基因組勘測序列是基因組DNA克隆的一次性部分測序序列，包括隨機(jī)的基因組勘測序列、cosmid/BAC/YAC末端序列、通過Exon trapped獲得基因組序列、通過Alu PCR獲得的序列以及轉(zhuǎn)座子標(biāo)記（transposon-tagged）序列等[6]。目前EST序列和GSS序列被廣泛地應(yīng)用于植物miRNA的預(yù)測分析，然而應(yīng)用GSS序列識別植物miRNA的數(shù)量與其GSS序列數(shù)量密切相關(guān)。Vishwakarma和Jadeja[7]對麻風(fēng)樹的46 862條EST和1 569條GSS序列發(fā)現(xiàn)24個(gè)miRNA基因；Katiyar等[8]對高粱240 161條EST和799 504條GSS序列發(fā)現(xiàn)31個(gè)新miRNA基因，但在mirBase數(shù)據(jù)庫中已有148個(gè)miRNA基因。羅曉燕等[6]對核果類作物107 982條EST和48 273條GSS分析發(fā)現(xiàn)11個(gè)miRNA。李婧等[9]對玉米中EST和GSS分析發(fā)現(xiàn)10個(gè)miRNA。本研究對木豆25 576條EST序列和90 109條GSS序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)43個(gè)miRNA基因，其識別效率與其它基于GSS的研究相差不大。靶基因分析發(fā)現(xiàn)，木豆miRNA主要調(diào)控核因子、泛素降解蛋白途徑參與蛋白、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白等36條編碼序列。然而Bartel等[10]認(rèn)為每個(gè)物種的miRNA數(shù)量應(yīng)該達(dá)到其基因數(shù)量的1%，Lewis等對人類的研究發(fā)現(xiàn)30%的基因都受到miRNA的調(diào)控[11]。因而對于木豆的miRNA基因和靶基因識別，還需要進(jìn)一步通過全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行生物信息學(xué)分析或通過小RNA測序等相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行識別。

參考文獻(xiàn)

[1]唐軍，王文強(qiáng)，黃春瓊，等.木豆育種及分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，33（8）：36-40.

[2]向錦，龐雯，王建紅.木豆在中國的應(yīng)用前景[J].四川草原，2003（4）：38-40.

[3]Yang TW，Xue LG，An LZ. Functional diversity of miRNA in plants[J].Plant Science，2007，172（3）：423-432.

[4]Milev I，Yahubyan G，Minkov I，et al.miRTour：Plant miRNA and target prediction tool[J].Bioinformation，2011，6（6）：248-249.

[5]Dai X，Zhao PX.psRNATarget：a plant small RNA target analysis server[J].Nucleic Acids Res，2011，39：W155-159.

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[7]Vishwakarma NP，Jadeja VJ.Identification of miRNA encoded by Jatropha curcas from EST and GSS[J].Plant Signal Behav，2013，8（2）：e23 152.

[8]Katiyar A，Smita S，Chinnusamy V，Pandey DM，Bansal K.Identification of miRNAs in sorghum by using bioinformatics approach[J].Plant Signal Behav，2012，7（2）：246-259.

[9]李婧，熊莉麗，胡久梅，等.基于EST 和GSS 序列的玉米未知微RNA的數(shù)據(jù)挖掘[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011，12：108-112.

[10]Bartel DP.MicroRNAs： Genomics，biogenesis，mechanism，and function[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[11]Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell，2005，120（1）：15-20.

（責(zé)編：張宏民）

3 結(jié)論與討論

EST序列，又稱表達(dá)序列標(biāo)簽，是從隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5′端和3′端單一次測序獲得的短的cDNA 部分序列。GSS序列，又稱基因組勘測序列是基因組DNA克隆的一次性部分測序序列，包括隨機(jī)的基因組勘測序列、cosmid/BAC/YAC末端序列、通過Exon trapped獲得基因組序列、通過Alu PCR獲得的序列以及轉(zhuǎn)座子標(biāo)記（transposon-tagged）序列等[6]。目前EST序列和GSS序列被廣泛地應(yīng)用于植物miRNA的預(yù)測分析，然而應(yīng)用GSS序列識別植物miRNA的數(shù)量與其GSS序列數(shù)量密切相關(guān)。Vishwakarma和Jadeja[7]對麻風(fēng)樹的46 862條EST和1 569條GSS序列發(fā)現(xiàn)24個(gè)miRNA基因；Katiyar等[8]對高粱240 161條EST和799 504條GSS序列發(fā)現(xiàn)31個(gè)新miRNA基因，但在mirBase數(shù)據(jù)庫中已有148個(gè)miRNA基因。羅曉燕等[6]對核果類作物107 982條EST和48 273條GSS分析發(fā)現(xiàn)11個(gè)miRNA。李婧等[9]對玉米中EST和GSS分析發(fā)現(xiàn)10個(gè)miRNA。本研究對木豆25 576條EST序列和90 109條GSS序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)43個(gè)miRNA基因，其識別效率與其它基于GSS的研究相差不大。靶基因分析發(fā)現(xiàn)，木豆miRNA主要調(diào)控核因子、泛素降解蛋白途徑參與蛋白、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白等36條編碼序列。然而Bartel等[10]認(rèn)為每個(gè)物種的miRNA數(shù)量應(yīng)該達(dá)到其基因數(shù)量的1%，Lewis等對人類的研究發(fā)現(xiàn)30%的基因都受到miRNA的調(diào)控[11]。因而對于木豆的miRNA基因和靶基因識別，還需要進(jìn)一步通過全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行生物信息學(xué)分析或通過小RNA測序等相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行識別。

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[11]Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell，2005，120（1）：15-20.

（責(zé)編：張宏民）

3 結(jié)論與討論

EST序列，又稱表達(dá)序列標(biāo)簽，是從隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5′端和3′端單一次測序獲得的短的cDNA 部分序列。GSS序列，又稱基因組勘測序列是基因組DNA克隆的一次性部分測序序列，包括隨機(jī)的基因組勘測序列、cosmid/BAC/YAC末端序列、通過Exon trapped獲得基因組序列、通過Alu PCR獲得的序列以及轉(zhuǎn)座子標(biāo)記（transposon-tagged）序列等[6]。目前EST序列和GSS序列被廣泛地應(yīng)用于植物miRNA的預(yù)測分析，然而應(yīng)用GSS序列識別植物miRNA的數(shù)量與其GSS序列數(shù)量密切相關(guān)。Vishwakarma和Jadeja[7]對麻風(fēng)樹的46 862條EST和1 569條GSS序列發(fā)現(xiàn)24個(gè)miRNA基因；Katiyar等[8]對高粱240 161條EST和799 504條GSS序列發(fā)現(xiàn)31個(gè)新miRNA基因，但在mirBase數(shù)據(jù)庫中已有148個(gè)miRNA基因。羅曉燕等[6]對核果類作物107 982條EST和48 273條GSS分析發(fā)現(xiàn)11個(gè)miRNA。李婧等[9]對玉米中EST和GSS分析發(fā)現(xiàn)10個(gè)miRNA。本研究對木豆25 576條EST序列和90 109條GSS序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)43個(gè)miRNA基因，其識別效率與其它基于GSS的研究相差不大。靶基因分析發(fā)現(xiàn)，木豆miRNA主要調(diào)控核因子、泛素降解蛋白途徑參與蛋白、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白等36條編碼序列。然而Bartel等[10]認(rèn)為每個(gè)物種的miRNA數(shù)量應(yīng)該達(dá)到其基因數(shù)量的1%，Lewis等對人類的研究發(fā)現(xiàn)30%的基因都受到miRNA的調(diào)控[11]。因而對于木豆的miRNA基因和靶基因識別，還需要進(jìn)一步通過全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行生物信息學(xué)分析或通過小RNA測序等相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行識別。

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[5]Dai X，Zhao PX.psRNATarget：a plant small RNA target analysis server[J].Nucleic Acids Res，2011，39：W155-159.

[6]羅曉燕，侍婷，蔡斌，等. 核果類果樹中microRNAs的生物信息學(xué)預(yù)測及驗(yàn)證[J].林業(yè)科學(xué)，2012，（48）2：75-81.

[7]Vishwakarma NP，Jadeja VJ.Identification of miRNA encoded by Jatropha curcas from EST and GSS[J].Plant Signal Behav，2013，8（2）：e23 152.

[8]Katiyar A，Smita S，Chinnusamy V，Pandey DM，Bansal K.Identification of miRNAs in sorghum by using bioinformatics approach[J].Plant Signal Behav，2012，7（2）：246-259.

[9]李婧，熊莉麗，胡久梅，等.基于EST 和GSS 序列的玉米未知微RNA的數(shù)據(jù)挖掘[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011，12：108-112.

[10]Bartel DP.MicroRNAs： Genomics，biogenesis，mechanism，and function[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[11]Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell，2005，120（1）：15-20.

（責(zé)編：張宏民）