氧氟沙星噬菌體庫的構建、篩選及抗體結構模擬
2014-07-10 21:23:59張秀媛等
分析化學 2014年6期
張秀媛等
摘 要 應用噬菌體展示和重組抗體技術制備抗氧氟沙星單鏈抗體（scFv）庫，篩選獲得氧氟沙星特異性噬菌體scFv以及同源模擬其三維結構。將從氧氟沙星雜交瘤細胞提取的總RNA，用RTPCR反轉錄合成cDNA， 以針對鼠源重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL）基因的兼并引物， 擴增獲得VH和VL可變區基因，通過SOEPCR法將VH基因和VL基因通過柔性多肽Linker
關鍵詞 氧氟沙星； 單鏈抗體； 噬菌體展示； 酶聯免疫分析
1 引 言
氧氟沙星（Ofloxacin）為第三代喹諾酮類抗菌藥，抗菌譜廣，對革蘭氏陽性菌及陰性菌均有強大的抗菌作用，對厭氧菌和肺炎支原體也有良好作用，廣泛應用于畜牧業生產中。喹諾酮類藥物對人體有一定副作用，包括對胃腸道不良反應、中樞神經系統不良反應、心臟的毒性作用[1]，在牲畜體內的殘留毒性會對環境及人體健康造成嚴重危害。
單鏈抗體作為第三代抗體，應用DNA重組技術及蛋白質工程技術將抗體基因進行加工、改造和重新裝配，然后克隆到合適的表達載體中，在適當的宿主細胞中表達并正確折疊成具有生物學功能的一種抗體分子。由于其具有分子小、免疫原性低、可塑性強及不需免疫動物可大批生產等優點，在酶聯免疫技術檢測環境和食品中抗菌素殘留方面顯示出前兩代抗體無法比擬的優點[2]。
目前，還沒有關于氧氟沙星噬菌體抗體庫構建的相關報道。本研究利用噬菌體表面呈現技術， 構建抗氧氟沙星噬菌體單鏈抗體庫， 從中篩選出具有抗原結合活性的抗氧氟沙星單鏈抗體噬菌體陽性克隆， 并獲得抗氧氟沙星特異性單鏈抗體的基因序列， 為進一步實現氧氟沙星免疫法快速檢測提供一種獲得抗氧氟沙星特異性抗體的新途徑。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
氧氟沙星雜交瘤細胞為本實驗室制備；
4 結 論
本實驗利用T7噬菌體構建噬菌體抗體庫。References
1 DONG JinHe， DONG Feng， ZHAO XianRong. Chinese Journal of Drug Abuse Prevention and Treatment， 2002， 41（6）： 13-14
董進和， 董 峰， 趙憲榮. 中國藥物濫用防治雜志， 2002， 41（6）： 13-14
2 PAN Ke， WANG Hong， ZHANG HongBin， SUN MingYuan. Journal of South China University of Technology， 2005， 11（33）： 51-54
潘 科， 王 弘， 張宏斌， 孫明遠. 華南理工大學學報， 2005， 11（33）： 51-54
3 Imai S， Mukai Y， Nagano K. Biological and Pharmaceutical Bulletin， 2006， 29（21）： 1325-1330
4 MIAO XiangYang， DING ShuYan. Scientia Agricultura Sinica， 2005， 38（6）： 1260-1263
苗向陽， 丁淑燕. 中國農業科學， 2005， 38（6）： 1260-1263
5 Poul M A， Becerril B， Nielsen U B. J Microbiol Methods， 2000， 301（5）： 1149-1161
6 Levinson H J S， Mudget tHunter M. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA， 1988， 85（20）： 5879-5883
7 Li T J， Zhang Q， Liu Y. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54（21）： 9085-9091
8 Abigail V J C， Adam P B， Andrew C R M. Journal of Molecular Biology， 2003， 325（45）： 337-354
9 Brichta J， Hnilova M， Viskovic T. Veterinarni Medicina， 2005， 50（6）： 231-252
Construction， Screening and Antibody Structure Homology
Modeling of Phage Single Chain Variable Fragment
Library Against Ofloxacin
ZHANG XiuYuan1， HE Kuo*1，2， DU XinJun2， WANG JunPing2， YANG Qing2
1（Heibei North University， Zhangjiakou 075000， China）
2（Tianjin University of Science and Technology，
Ministry of Education Key Laboratoryof Food Nutrition and Safety， Tianjin 300457， China）
Abstract To construct a library of mouse single chain variable fragment （scFv） antibody against ofloxacin using phage display and recombinant antibody technique， specific antiofloxacin scFv was screened and 3D structure was homology modeling. Total RNA was extracted from hybridoma cell of ofloxacin mAb， and was used to amplify VH and VL gene by RTPCR using random primer. Then they were linked by a DNA linker encoding （G1y4Ser）3 as VHlinkerVL sequence forming scFv by SOE（splicing by overlap extension） PCR. These fragments were inserted into phage T7 after double digestion and transformed with host bacteria BLT5403.3×105 pfu/ml single chain antibody phage libraries were successfully constructed. Four positive phage scFv clones were screened by direct competitive ELISA after four times of enriched procedure in the order of adsorptionelutionamplificatio， 3D structure of specific scFv was homology modeling finally. This research lays a foundation for further massive expression of antiofloxacin scFv.
Keywords Ofloxacin； Single chain antibody phage libraries； Phage display； Enzymelinked immumoadsorbent assay（Received 17 October 2013； Accepted 24 March 2014）
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.20905058）
摘 要 應用噬菌體展示和重組抗體技術制備抗氧氟沙星單鏈抗體（scFv）庫，篩選獲得氧氟沙星特異性噬菌體scFv以及同源模擬其三維結構。將從氧氟沙星雜交瘤細胞提取的總RNA，用RTPCR反轉錄合成cDNA， 以針對鼠源重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL）基因的兼并引物， 擴增獲得VH和VL可變區基因，通過SOEPCR法將VH基因和VL基因通過柔性多肽Linker
關鍵詞 氧氟沙星； 單鏈抗體； 噬菌體展示； 酶聯免疫分析
1 引 言
氧氟沙星（Ofloxacin）為第三代喹諾酮類抗菌藥，抗菌譜廣，對革蘭氏陽性菌及陰性菌均有強大的抗菌作用，對厭氧菌和肺炎支原體也有良好作用，廣泛應用于畜牧業生產中。喹諾酮類藥物對人體有一定副作用，包括對胃腸道不良反應、中樞神經系統不良反應、心臟的毒性作用[1]，在牲畜體內的殘留毒性會對環境及人體健康造成嚴重危害。
單鏈抗體作為第三代抗體，應用DNA重組技術及蛋白質工程技術將抗體基因進行加工、改造和重新裝配，然后克隆到合適的表達載體中，在適當的宿主細胞中表達并正確折疊成具有生物學功能的一種抗體分子。由于其具有分子小、免疫原性低、可塑性強及不需免疫動物可大批生產等優點，在酶聯免疫技術檢測環境和食品中抗菌素殘留方面顯示出前兩代抗體無法比擬的優點[2]。
目前，還沒有關于氧氟沙星噬菌體抗體庫構建的相關報道。本研究利用噬菌體表面呈現技術， 構建抗氧氟沙星噬菌體單鏈抗體庫， 從中篩選出具有抗原結合活性的抗氧氟沙星單鏈抗體噬菌體陽性克隆， 并獲得抗氧氟沙星特異性單鏈抗體的基因序列， 為進一步實現氧氟沙星免疫法快速檢測提供一種獲得抗氧氟沙星特異性抗體的新途徑。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
氧氟沙星雜交瘤細胞為本實驗室制備；
4 結 論
本實驗利用T7噬菌體構建噬菌體抗體庫。References
1 DONG JinHe， DONG Feng， ZHAO XianRong. Chinese Journal of Drug Abuse Prevention and Treatment， 2002， 41（6）： 13-14
董進和， 董 峰， 趙憲榮. 中國藥物濫用防治雜志， 2002， 41（6）： 13-14
2 PAN Ke， WANG Hong， ZHANG HongBin， SUN MingYuan. Journal of South China University of Technology， 2005， 11（33）： 51-54
潘 科， 王 弘， 張宏斌， 孫明遠. 華南理工大學學報， 2005， 11（33）： 51-54
3 Imai S， Mukai Y， Nagano K. Biological and Pharmaceutical Bulletin， 2006， 29（21）： 1325-1330
4 MIAO XiangYang， DING ShuYan. Scientia Agricultura Sinica， 2005， 38（6）： 1260-1263
苗向陽， 丁淑燕. 中國農業科學， 2005， 38（6）： 1260-1263
5 Poul M A， Becerril B， Nielsen U B. J Microbiol Methods， 2000， 301（5）： 1149-1161
6 Levinson H J S， Mudget tHunter M. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA， 1988， 85（20）： 5879-5883
7 Li T J， Zhang Q， Liu Y. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54（21）： 9085-9091
8 Abigail V J C， Adam P B， Andrew C R M. Journal of Molecular Biology， 2003， 325（45）： 337-354
9 Brichta J， Hnilova M， Viskovic T. Veterinarni Medicina， 2005， 50（6）： 231-252
Construction， Screening and Antibody Structure Homology
Modeling of Phage Single Chain Variable Fragment
Library Against Ofloxacin
ZHANG XiuYuan1， HE Kuo*1，2， DU XinJun2， WANG JunPing2， YANG Qing2
1（Heibei North University， Zhangjiakou 075000， China）
2（Tianjin University of Science and Technology，
Ministry of Education Key Laboratoryof Food Nutrition and Safety， Tianjin 300457， China）
Abstract To construct a library of mouse single chain variable fragment （scFv） antibody against ofloxacin using phage display and recombinant antibody technique， specific antiofloxacin scFv was screened and 3D structure was homology modeling. Total RNA was extracted from hybridoma cell of ofloxacin mAb， and was used to amplify VH and VL gene by RTPCR using random primer. Then they were linked by a DNA linker encoding （G1y4Ser）3 as VHlinkerVL sequence forming scFv by SOE（splicing by overlap extension） PCR. These fragments were inserted into phage T7 after double digestion and transformed with host bacteria BLT5403.3×105 pfu/ml single chain antibody phage libraries were successfully constructed. Four positive phage scFv clones were screened by direct competitive ELISA after four times of enriched procedure in the order of adsorptionelutionamplificatio， 3D structure of specific scFv was homology modeling finally. This research lays a foundation for further massive expression of antiofloxacin scFv.
Keywords Ofloxacin； Single chain antibody phage libraries； Phage display； Enzymelinked immumoadsorbent assay（Received 17 October 2013； Accepted 24 March 2014）
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.20905058）
摘 要 應用噬菌體展示和重組抗體技術制備抗氧氟沙星單鏈抗體（scFv）庫，篩選獲得氧氟沙星特異性噬菌體scFv以及同源模擬其三維結構。將從氧氟沙星雜交瘤細胞提取的總RNA，用RTPCR反轉錄合成cDNA， 以針對鼠源重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL）基因的兼并引物， 擴增獲得VH和VL可變區基因，通過SOEPCR法將VH基因和VL基因通過柔性多肽Linker
關鍵詞 氧氟沙星； 單鏈抗體； 噬菌體展示； 酶聯免疫分析
1 引 言
氧氟沙星（Ofloxacin）為第三代喹諾酮類抗菌藥，抗菌譜廣，對革蘭氏陽性菌及陰性菌均有強大的抗菌作用，對厭氧菌和肺炎支原體也有良好作用，廣泛應用于畜牧業生產中。喹諾酮類藥物對人體有一定副作用，包括對胃腸道不良反應、中樞神經系統不良反應、心臟的毒性作用[1]，在牲畜體內的殘留毒性會對環境及人體健康造成嚴重危害。
單鏈抗體作為第三代抗體，應用DNA重組技術及蛋白質工程技術將抗體基因進行加工、改造和重新裝配，然后克隆到合適的表達載體中，在適當的宿主細胞中表達并正確折疊成具有生物學功能的一種抗體分子。由于其具有分子小、免疫原性低、可塑性強及不需免疫動物可大批生產等優點，在酶聯免疫技術檢測環境和食品中抗菌素殘留方面顯示出前兩代抗體無法比擬的優點[2]。
目前，還沒有關于氧氟沙星噬菌體抗體庫構建的相關報道。本研究利用噬菌體表面呈現技術， 構建抗氧氟沙星噬菌體單鏈抗體庫， 從中篩選出具有抗原結合活性的抗氧氟沙星單鏈抗體噬菌體陽性克隆， 并獲得抗氧氟沙星特異性單鏈抗體的基因序列， 為進一步實現氧氟沙星免疫法快速檢測提供一種獲得抗氧氟沙星特異性抗體的新途徑。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
氧氟沙星雜交瘤細胞為本實驗室制備；
4 結 論
本實驗利用T7噬菌體構建噬菌體抗體庫。References
1 DONG JinHe， DONG Feng， ZHAO XianRong. Chinese Journal of Drug Abuse Prevention and Treatment， 2002， 41（6）： 13-14
董進和， 董 峰， 趙憲榮. 中國藥物濫用防治雜志， 2002， 41（6）： 13-14
2 PAN Ke， WANG Hong， ZHANG HongBin， SUN MingYuan. Journal of South China University of Technology， 2005， 11（33）： 51-54
潘 科， 王 弘， 張宏斌， 孫明遠. 華南理工大學學報， 2005， 11（33）： 51-54
3 Imai S， Mukai Y， Nagano K. Biological and Pharmaceutical Bulletin， 2006， 29（21）： 1325-1330
4 MIAO XiangYang， DING ShuYan. Scientia Agricultura Sinica， 2005， 38（6）： 1260-1263
苗向陽， 丁淑燕. 中國農業科學， 2005， 38（6）： 1260-1263
5 Poul M A， Becerril B， Nielsen U B. J Microbiol Methods， 2000， 301（5）： 1149-1161
6 Levinson H J S， Mudget tHunter M. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA， 1988， 85（20）： 5879-5883
7 Li T J， Zhang Q， Liu Y. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54（21）： 9085-9091
8 Abigail V J C， Adam P B， Andrew C R M. Journal of Molecular Biology， 2003， 325（45）： 337-354
9 Brichta J， Hnilova M， Viskovic T. Veterinarni Medicina， 2005， 50（6）： 231-252
Construction， Screening and Antibody Structure Homology
Modeling of Phage Single Chain Variable Fragment
Library Against Ofloxacin
ZHANG XiuYuan1， HE Kuo*1，2， DU XinJun2， WANG JunPing2， YANG Qing2
1（Heibei North University， Zhangjiakou 075000， China）
2（Tianjin University of Science and Technology，
Ministry of Education Key Laboratoryof Food Nutrition and Safety， Tianjin 300457， China）
Abstract To construct a library of mouse single chain variable fragment （scFv） antibody against ofloxacin using phage display and recombinant antibody technique， specific antiofloxacin scFv was screened and 3D structure was homology modeling. Total RNA was extracted from hybridoma cell of ofloxacin mAb， and was used to amplify VH and VL gene by RTPCR using random primer. Then they were linked by a DNA linker encoding （G1y4Ser）3 as VHlinkerVL sequence forming scFv by SOE（splicing by overlap extension） PCR. These fragments were inserted into phage T7 after double digestion and transformed with host bacteria BLT5403.3×105 pfu/ml single chain antibody phage libraries were successfully constructed. Four positive phage scFv clones were screened by direct competitive ELISA after four times of enriched procedure in the order of adsorptionelutionamplificatio， 3D structure of specific scFv was homology modeling finally. This research lays a foundation for further massive expression of antiofloxacin scFv.
Keywords Ofloxacin； Single chain antibody phage libraries； Phage display； Enzymelinked immumoadsorbent assay（Received 17 October 2013； Accepted 24 March 2014）
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.20905058）
