EAE發病機制中MALT1、IL—17作用的探討

王貴泉+張宇+張美妮

【摘要】 目的：通過建立實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠模型，觀察小鼠腦組織中黏膜相關淋巴組織淋巴瘤轉運蛋白1與血清白介素-17（Interleukin-17）的表達情況，并探討兩者在EAE發病機制中的作用。進一步探究MALTI是否可以作為多發性硬化（MS）的治療靶點，以便尋找治療MS的新手段。方法：將36只C57BL/6雌性小鼠按照隨機數字表法分為EAE組和佐劑組各18只，EAE組采用MOG與完全弗氏佐劑的沫狀混合物制備EAE模型，佐劑組僅給予弗氏佐劑。觀察每只實驗動物發病情況并每隔2 d進行一次神經功能評分。分別于免疫后14 d、24 d、40 d兩組小鼠隨機各取6只，心臟取血并4%多聚甲醛灌注取腦組織。取小鼠腦組織石蠟切片，免疫組化方法檢測各組小鼠腦組織中MALT1并用ELISA法檢測血清IL-17表達。結果：EAE組與佐劑組的小鼠神經功能評分、體重、血清中IL-17含量和腦組織中MALT1蛋白陽性細胞數比較差異均有統計學意義（P<0.05）。EAE組中24 d組小鼠的神經功能評分（2.50±0.55）分明顯高于14 d組的（0.83±0.41）分和40 d組的（1.50±0.32）分，體重（17.04±0.41）g明顯少于14 d組的（18.33±0.49）g和40 d組的（18.15±0.13）g，且血清中IL-17含量（288.00±26.45）pg/mL明顯高于14 d組的（122.60±10.11）pg/mL和40 d組的（184.40±29.51）pg/mL，腦組織中MALT1蛋白陽性細胞數（183.80±9.25）個明顯多于14 d組的（78.25±9.47）個和40 d組的（133.50±19.87）個，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：EAE小鼠神經功能評分越高，血清中IL-17含量越高，MALT1表達也越多，提示MALT1參與了EAE小鼠的發病過程，其機制可能與MALT1在EAE小鼠上調血清IL-17表達有關。

【關鍵詞】 實驗性自身免疫性腦脊髓炎； 多發性硬化； 黏膜相關淋巴組織淋巴瘤轉運蛋白1； 白介素17

多發性硬化是一種中樞神經系統白質的炎性脫髓鞘疾病，實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是人類中樞神經系統常見的脫髓鞘疾病即多發性硬化（multiple sclerosis，MS）的動物模型[1-2]。但其發病機制尚不清楚。在對EAE模型的研究中發現，自身反應性腦炎性Th1和Th17 CD4+T細胞通過免疫活化并入侵中樞神經系統，促進單核細胞與中性粒細胞等免疫效應細胞聚集并引起與人類多發性硬化（MS）臨床癥狀、組織病理變化相類似的脫髓鞘等自身免疫性炎癥[3-4]。IL-17是Th17細胞分泌的致炎性細胞因子，具有強烈的致炎作用，引起中樞神經系統脫髓鞘病變[5]。有學者認為，核轉錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）活化后進入細胞核調節炎癥因子表達而引起脫髓鞘病變[6]。黏膜相關淋巴組織淋巴瘤轉運蛋白1（Mucosa associated lymphoid tissue lymphoma transport protein 1，MALT1）被認為是NF-κB通路的激活物，利用敲除MALT1基因的小鼠誘導EAE，即使有淋巴細胞浸潤，也無EAE的任何癥狀[7-8]。目前國內關于EAE的研究主要集于IL-17尚無MALT1在EAE發病機制中作用的相關報道，本實驗旨在探討MALT1及IL-17在EAE小鼠發病機制中作用的探討。

1 材料與方法

1.1 實驗分組 將18～20 g，8～10周，C57BL/6雌性小鼠（北京維通利華實驗動技術有限公司）36只按照隨機數字表法分為EAE組和佐劑組各18只。兩組小鼠一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05）具有可比性。

1.2 EAE模型制備 用0.01 mol/L的PBS將MOG35-55（武漢博士德公司）稀釋。然后將稀釋液與等量含結核分枝桿菌的完全弗氏佐劑（武漢博士德公司）混合，用玻璃注射器抽吸成油包水狀，制成誘導EAE的抗原乳劑。EAE組小鼠背部中央偏頭側皮下點注射抗原乳劑。利用生理鹽水代替MOG35-55稀釋液參照上述方法制備乳劑，供對照組使用。各組于免疫后第0天、第2天分別進行腹腔注射百日咳毒素（美國Sigma公司）600 ng/只作為免疫增強劑。

1.3 數據采集 小鼠經MOG免疫后第8天開始，隔日采用盲法由兩名觀察者稱量并記錄每只小鼠的體重，采用國際通用的5分評分制對小鼠進行神經功能評分。評分標準：0分，無任何癥狀；1分，尾部張力消失，可見輕度步態笨拙；2分，一側后下肢無力，被動翻身后可以恢復；3分，雙后肢癱瘓，被動翻身后不能恢復，但給予刺激后可以挪動；4分，雙側后肢癱瘓伴前肢癱瘓；5分，瀕死狀態或死亡。癥狀介于兩者標準之間者以±0.5計。

1.4 小鼠組織提取 分別于免疫后14、24、40 d，于EAE組與佐劑組中隨機抓取各6只小鼠（即14 d組、24 d組、40 d組），用10%水合氯醛0.1 mL/20 mg腹腔注射麻醉后，小鼠左心取血并編號，左心室灌注磷酸鹽緩沖液至肝臟變白，再使用4%多聚甲醛至尾部僵直，解剖取大腦并編號。

1.5 ELISA法檢測血清IL-17 小鼠血液離心后取血清零下70 ℃保存，IL-17的濃度采用上海西唐生物科技有限公司的ELISA試劑盒，具體方法參照試劑盒說明書。參照各因子的標準曲線計算其含量，結果以pg/mL表示。

1.6 免疫組化 小鼠腦組織提取后于4%多聚甲醛中浸泡過夜，并脫水，石蠟包塊，MALT1抗體（1抗、2抗）購自武漢博士德公司。參照試劑盒說明書操作，并在相關技術指導老師指導下進行。

1.7 統計學處理 采用GraphPad Prism 5.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，多組間參數比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠臨床癥狀評分與體重變化 EAE組小鼠8 d到10 d陸續開始發病，發病時表現為皮毛不光滑、食欲下降、體重減輕、活動量減少；同時相繼出現中樞神經系統受損癥狀，首先是表現為尾部肌張力低下，身體向一側傾倒，進一步進展為雙側后肢無力，不能翻身或翻身力弱，靠前肢爬行，無因病情危重而死亡。佐劑組小鼠一直沒出現神經系統癥狀，體重持續上升，與EAE小鼠相比，神經功能評分差異顯著。如圖1所示，EAE組中14 d組小鼠神經功能評分（0.83±0.41）分，24 d組小鼠神經功能評分（2.50±0.55）分，40 d組小鼠神經功能評分（1.50±0.32）分，其中兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。EAE組與佐劑組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。如圖2所示，EAE組中14 d組小鼠體重為（18.33±0.49）g，24 d組小鼠體重為（17.04±0.41）g，40 d組小鼠體重為（18.15±0.13）g，其中14 d組與24 d組比較，24 d組與40 d組比較差異均有統計學意義（P<0.01），14 d組與40 d組比較差異無統計學意義（P>0.05）。佐劑組中兩兩比較差異均無統計學意義（P>0.05），EAE組與佐劑組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.2 IL-17檢測結果 IL-17在血清中的ELISA檢測，用ELISA方法檢測血清中IL-17 OD值，用軟件換算OD值與IL-17的濃度。EAE組中24 d組的小鼠血清中的IL-17濃度明顯高于14 d組和40 d組，差異均有統計學意義（P<0.05）。佐劑組中24 d組小鼠血清中的IL-17含量與14 d組和40 d組比較差異均無統計學意義（P>0.05），而EAE組各小組與佐劑組比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。結果表明，神經功能評分較高時IL-17含量也較高。

2.3 MALT1免疫組化結果 采用免疫組化法（SV002兔-IgG-兩步法）檢測MALTI蛋白表達，其具體的步驟按照試劑盒說明書進行。每組選取染色清晰石蠟切片，光鏡下（40×）隨機選取3個視野，并在高倍鏡下（400×）觀察星形膠質細胞胞漿可見免疫陽性細胞，并計數。結果顯示，EAE組中24 d組的陽性細胞數明顯多于14 d組和40 d組，且EAE組中40 d組的陽性細胞數明顯多于14 d組，差異均有統計學意義（P<0.05）。而佐劑組中14 d組、24 d組和40 d組的陽性細胞數兩兩比較，差異均無統計學意義（P>0.05），而EAE組各小組與佐劑組比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

3 討論

MALT1作為NF-κB通路的一個激活成分，神經系統內NF-κB主要存在于神經元、血管內皮細胞及膠質細胞，NF-κB是調控炎性反應的重要信號系統，在EAE免疫調節及炎性反應發展中有重要意義[7，9]。該信號系統能調控多種黏附分子、生長因子、細胞因子以及急性期蛋白的表達，并在炎性反應和免疫誘導、細胞增殖和分化等EAE多種病理過程中發揮重要作用。此外NF-κB可促進黏附分子表達，介導外周炎性細胞進入腦組織[10]。MALT1基因剔除法表明，MALT1的支架功能在T細胞抗原受體（TCR）信號刺激的下游NF-κB活化中是必不可少的[11]。其蛋白酶活性對成熟的NF-κB反應也是相當重要的，該反應決定了T細胞活化的程度[12]。

有研究發現，炎性細胞Th17被認為是誘導EAE的主要反應細胞，而Th17細胞產生致炎性細胞因子IL-17，其具有強烈的致炎作用，從而引起中樞神經系統脫髓鞘病變[5]。本實驗結果顯示，MALT1陽性細胞數較多時，該小鼠血清中IL-17的含量也較高，同時其肢體功能障礙也較嚴重，這些結果提示MALT1可以促使IL-17的分泌。本結果可能與MALT1激活NF-κB通路，導致Th0細胞向Th17細胞分化有關。本實驗結果與有些學者研究的MALT1影響Th17細胞的致炎性作用相似。

綜上所述，MALT1在EAE小鼠發病中有極其重要的作用，其機制可能是由于MALT1是NF-κB通路激活過程中一個重要的中心環節，并通過激活NF-κB而上調IL-17在血清中的含量，進而引起自身免疫性脫髓鞘病變。進一步研究如何抑制MALT1的表達或者抑制其激活NF-κB通路，可以為今后探索MS的治療靶點提供新思路。

參考文獻

[1]王超，劉廣志，高旭光.多發性硬化的T細胞研究進展[J].中國神經免疫學和神經病學雜志，2009，16（2）：151-152.

[2]袁錦楣.臨床神經免疫學[M].北京：北京科學技術出版社，1992：123.

[3] Baxter A G.The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Nature Reviews Immunology，2007，7（11）：904-912.

[4] Steinman L，Zamvil S S.Virtues and pitfalls of EAE for the development of therapies for multiple sclerosis[J].Trends Immunol，2005，26（11）：565-571.

[5] Nakae S，Komiyama Y，Nambu A，et al.Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice，causing suppression of allergic cellular and humoral responses[J].Immunity，2002，17（3）：375-387.

[6] Baeuerle P A，Henkel T.Function and activation of NF-kappaB in the immune system[J].Annu Rev Immunol，1994，12（1）：141-179.

[7] Mc Guire C，Wieghofer P，Elton L，et al.Paracaspase MALT1 deficiency protects mice from autoimmune-mediated demyelination[J].The Journal of Immunology，2013，190（6）：2896-2903.

[8] Brüstle A，Brenner D，Knobbe C B，et al.The NF-κB regulator MALT1 determines the encephalitogenic potential of Th17 cells[J].J Clin Invest，2012，122（12）：4698.

[9] Vallabhapurapu S，Karin M.Regulation and function of NF-κB transcription factors in the immune system[J].Annu Rev Immunol，2009，28（27）：693-733.

[10]董為偉.神經保護的基礎與臨床[M].北京：科學出版社，2009：222-238.

[11] Korn T，Mitsdoerffer M，Croxford A L，et al.IL-6 controls Th17 immunity in vivo by inhibiting the conversion of conventional T cells into Foxp3+ regulatory T cells[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2008，105（47）：18460-18465.

[12] Codarri L，Gyülvészi G，Tosevski V，et al.ROR gammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells，which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation[J].Nat Immunol，2011，12（6）：560-567.

（收稿日期：2014-03-14） （本文編輯：歐麗）

[6] Baeuerle P A，Henkel T.Function and activation of NF-kappaB in the immune system[J].Annu Rev Immunol，1994，12（1）：141-179.

[7] Mc Guire C，Wieghofer P，Elton L，et al.Paracaspase MALT1 deficiency protects mice from autoimmune-mediated demyelination[J].The Journal of Immunology，2013，190（6）：2896-2903.

[8] Brüstle A，Brenner D，Knobbe C B，et al.The NF-κB regulator MALT1 determines the encephalitogenic potential of Th17 cells[J].J Clin Invest，2012，122（12）：4698.

[9] Vallabhapurapu S，Karin M.Regulation and function of NF-κB transcription factors in the immune system[J].Annu Rev Immunol，2009，28（27）：693-733.

[10]董為偉.神經保護的基礎與臨床[M].北京：科學出版社，2009：222-238.

[11] Korn T，Mitsdoerffer M，Croxford A L，et al.IL-6 controls Th17 immunity in vivo by inhibiting the conversion of conventional T cells into Foxp3+ regulatory T cells[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2008，105（47）：18460-18465.

[12] Codarri L，Gyülvészi G，Tosevski V，et al.ROR gammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells，which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation[J].Nat Immunol，2011，12（6）：560-567.

（收稿日期：2014-03-14） （本文編輯：歐麗）

[6] Baeuerle P A，Henkel T.Function and activation of NF-kappaB in the immune system[J].Annu Rev Immunol，1994，12（1）：141-179.

[7] Mc Guire C，Wieghofer P，Elton L，et al.Paracaspase MALT1 deficiency protects mice from autoimmune-mediated demyelination[J].The Journal of Immunology，2013，190（6）：2896-2903.

[8] Brüstle A，Brenner D，Knobbe C B，et al.The NF-κB regulator MALT1 determines the encephalitogenic potential of Th17 cells[J].J Clin Invest，2012，122（12）：4698.

[9] Vallabhapurapu S，Karin M.Regulation and function of NF-κB transcription factors in the immune system[J].Annu Rev Immunol，2009，28（27）：693-733.

[10]董為偉.神經保護的基礎與臨床[M].北京：科學出版社，2009：222-238.

[11] Korn T，Mitsdoerffer M，Croxford A L，et al.IL-6 controls Th17 immunity in vivo by inhibiting the conversion of conventional T cells into Foxp3+ regulatory T cells[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2008，105（47）：18460-18465.

[12] Codarri L，Gyülvészi G，Tosevski V，et al.ROR gammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells，which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation[J].Nat Immunol，2011，12（6）：560-567.

（收稿日期：2014-03-14） （本文編輯：歐麗）