亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與先天神經管缺陷的相關性研究

張潔瓊　徐東萍

[摘要] 目的 研究亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與紅細胞葉酸濃度的關系。 方法 采用PCR法對育齡女性5 128例進行亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性分析，并分別給予早孕者400μg、800μg葉酸口服補充1個月，比較干預前后紅細胞葉酸濃度。 結果 純合CC型早孕受試者口服400 μg葉酸1個月后平均紅細胞葉酸濃度與口服800 μg葉酸者相比較，差異無統計學意義（P >0.05）；突變基因型CT型、TT型早孕受試者差異則均具有統計學意義（P <0.05）。結論 對育齡婦女開展MTHFR基因多態性檢測有利于指導補充葉酸劑量，值得臨床進一步研究。

[關鍵詞] 亞甲基四氫葉酸還原酶； 基因多態性；葉酸；神經管缺陷

[中圖分類號] R722.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）13-0016-03

出生缺陷的圍生兒中神經管缺陷約占21%，占比最高，中國每年約有8萬～10萬名神經管缺陷兒出生 [1]。隨著近年來分子生物學技術的發展，葉酸代謝障礙被認為與多種出生缺陷疾病有關，如神經管缺陷、唇腭裂、先天性心臟病和唐氏綜合征等[2]。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是葉酸代謝的關鍵酶，一旦MTHFR基因發生突變，則導致人體攝入的葉酸無法轉換成有效形式，葉酸利用率下降；MTHFR基因677位核苷酸的多態性形成了CC、CT和TT 3種基因型，相對于正常的CC基因型，雜合的CT基因型MTHFR酶活性降低35%，純合的TT基因型活性降低70%。MTHFR基因突變導致酶活性的改變，引起葉酸利用障礙，增加了發生神經管畸形（NTDs）的風險[3]。預防性補充葉酸防止出生缺陷已經得到了世界范圍內的認可。婦產科醫師通常按照統一的劑量（400μg）來建議孕期女性服用葉酸，標準劑量的葉酸補充可能無法滿足MTHFR基因發生突變的女性胎兒發育需要[4]。因此對孕期女性進行基因檢測以指導臨床個性化用藥是必要的，本研究擬通過本地區育齡女性的MTHFR基因大樣本檢測，了解該地區育齡女性MTHFR基因的多態性分布情況，并探討MTHFR基因多態性與服用葉酸前后紅細胞葉酸濃度的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

經我院倫理委員會批準，收集2009年1月～2013年6月期間就診于我院門診的育齡女性，入選標準：育齡期漢族女性，同意抽血化驗。病例排除標準：中晚期孕婦；合并慢性肝腎疾病、血液系統病、惡性貧血、胃十二指腸切除術后、精神障礙性疾病。入選實驗對象5 128例，其中早孕（孕8～14周）育齡女性753例作為早孕組。

1.2治療干預方法

所有入選者均抽取空腹靜脈血2mL到乙二胺四乙酸（EDTA）-Na2抗凝管中，置-70℃冰箱中備用提取基因組DNA進行MTHFR基因多態性檢測。早孕受試者根據MTHFR基因多態性檢測結果分為CC組、CT組、TT組，然后每個組再隨機分為兩組，分別給予400μg、800μg不同劑量的葉酸口服補充1個月。口服葉酸前及服用1個月以后均晨空腹抽取靜脈全血4mL，加入EDTA抗凝試管內檢測紅細胞葉酸濃度。

1.3 觀察指標及檢測方法

所有入選者均采用PCR法進行C677T 位點MTHFR基因多態性檢測；早孕者口服葉酸前后檢測紅細胞葉酸水平。

1.3.1 MTHFR基因檢測 首先利用常規飽和酚-氯仿抽提法從全血中提取基因組DNA，測定DNA純度和濃度后-20℃保存備用。MTHFR基因多態性檢測采用PCR法：①MTHFR-C677T引物設計 參照文獻進行，上游引物5-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3，下游引物5-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3，均由上海生物工程技術公司提供；②PCR反應體系 總體積25μL，其中ddH20 18.5μL，10×緩沖液2.5μL，10mM的dNTPs 1μL，12.5pmol/μL的引物各lμL，DNA lμL，所用DNA提取試劑盒由Takara公司生產（Code No.： R004A）；③PCR反應條件 94℃預變性5 min。94℃變性30 s，58℃復性45s，72℃延伸45 s，35個循環；72℃終末延伸10 min，最后置于4℃保存；④擴增產物的限制性酶切 取PCR擴增產物8止，用8 U TaqI限制性內切酶于37℃酶切6 h，反應終止后，產物經3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，染色后以DL 75 bp DNA片段長度標準物為參考，在紫外燈下判斷結果，并拍照分析基因型[5]。

1.3.2紅細胞葉酸濃度檢測 采用化學發光法檢測抗凝血中紅細胞葉酸濃度，紅細胞葉酸檢測儀由山東鑫科生物科技股份有限公司生產提供。

1.4統計學方法

應用SPSS17.0軟件包行統計研究，計量資料用平均數±標準差形式表示，采用t檢驗；計數資料用相對數表示，采用χ2檢驗，設定a=0.05、即P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 本地區育齡女性MTHFR基因的多態性分布情況

MTHFR基因型PCR擴增產物片段大小為134 bp，根據限制性內切酶Taq I酶切片段的情況，基因型有三種，CC型（134 bp 1條帶），CT型（134 bp，75 bp，59 bp 3條帶），TT型（75 bp，59 bp 2條帶）。本次普查本地區育齡女性共檢出CC型（正常基因）1 689例，CT型（雜合突變型）2 357例，TT型（純合突變型）1 082例，基因多態性位點遺傳平衡檢驗見表1。早孕組共檢出CC型（正常基因）210例，CT型（雜合突變型）375例，TT型（純合突變型）168例，基因多態性位點遺傳平衡檢驗見表2。

表1 本地區育齡女性MTHFR基因的多態性位點遺傳平衡檢驗

表2 本地區早孕女性MTHFR基因的多態性位點遺傳平衡檢驗

2.2 MTHFR基因多態性與服用葉酸前后紅細胞葉酸濃度的相關性

本組早期孕婦干預前CT型平均紅細胞葉酸濃度（274.5±28.5）nmol/L，TT型平均紅細胞葉酸濃度（257.3±33.4）nmol/L，與CC型平均紅細胞葉酸濃度（297.2±31.3）nmol/L相比較，差異具有統計學意義（t1=8.152，P=0.015；t2=10.213，P=0.010）。口服400 μg葉酸1個月前后，CC型早孕受試者差異比較具有統計學意義（P<0.05），CT型、TT型差異無統計學意義（P>0.05）；口服800 μg葉酸1個月前后，CC型、CT型、TT型早孕受試者差異比較均具有統計學意義（P<0.05）。CC型早孕受試者口服400 μg葉酸1個月后平均紅細胞葉酸濃度與口服800 μg葉酸者相比較，差異無統計學意義（P>0.05）；CT型、TT型早孕受試者口服400 μg葉酸1個月后平均紅細胞葉酸濃度與口服800 μg葉酸者分別相比較，差異均具有統計學意義（P<0.05），詳見表3。

3 討論

神經管缺陷（neural tube defects，NTDs）是因神經管上皮的早期發生及分化紊亂而導致的一種最常見且后果嚴重的出生缺陷畸形，包括脊柱裂、無腦兒、脊髓脊膜或腦膜膨出、顱脊柱裂等臨床類型，是引起自然流產、死胎、死產及新生兒死亡最重要因素[6]。目前NTDs發病機制尚不清楚，一般認為是環境與遺傳因素共同作用的結果，當前的研究熱點是NTDs與同型半胱氨酸代謝相關性；近年來葉酸代謝途徑中酶體系多態性與神經管缺陷發生相關性研究得到關注 [7]。

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（5，10-methyl-netetrahydrofolate，MTHFR）屬人同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）代謝途徑過程中的關鍵酶，其主要作用是催化5，10-亞甲基四氫葉酸經還原反應轉變5-甲基四氫葉酸的[8]。5-甲基四氫葉酸是葉酸的一種重要活性形式。而葉酸是蛋氨酸代謝中限速反應過程，5-甲基四氫葉酸可脫落活性甲基并轉給同型半胱氨酸（Hcy），生成蛋氨酸。葉酸過低，則會引起蛋氨酸合成量的減少，導致血中同型半胱氨酸（Hcy）積存過多，這在孕早期階段會干擾神經管的閉合，從而發生神經管缺陷性胎兒[9，10]。研究發現，MTHFR基因的C677T突變可導致的酶活性和熱敏感性降低，使身體對低葉酸水平的耐受范圍縮窄[11，12]。但是如果機體攝入大量的葉酸而且沒有其他半胱氨酸代謝酶缺陷存在時，由于酶活反應底物濃度增加，同樣可以維持正常的Hcy代謝，MTHFR基因的C677T突變則不會引起高Hcy血癥，但是葉酸攝入不足時，MTHFR基因突變則可導致高Hcy血癥[13]。

雖然MTHFR基因突變頻率存在明顯的地區、種族差異，但來自不同地區的大樣本數據研究均證實，母親C677T突變是導致NTD兒遺傳風險的高危因素，MTHFR基因C677T型為子代發生NTD的危險因素之一[14]。我們的研究結果表明，早期孕婦CT型、TT型紅細胞葉酸濃度相對較低，補充較大劑量（800 μg）葉酸時能夠有效地維持紅細胞葉酸濃度，常規劑量400 μg一定程度上不能滿足MTHFR基因C677T型突變孕婦的正常葉酸水平需求。

綜上所述，針對育齡婦女開展MTHFR基因多態性檢測，并用以指導孕期口服補充葉酸劑量的選擇，值得臨床進一步研究嘗試。

[參考文獻]

[1] 畢勝，潘尚哈，張昱，等. 葉酸、維生素B12，MTHFR基因及血漿同型半胱氨酸水平與Alzheimer病關系的研究[J]. 中國現代醫學雜志，2004，14（19）：15-18.

[2] 張海洋，張金華，張會敏，等. MTHFR基因多態性與腦卒中的相關性[J]. 中國老年學雜志，2012，32（4）：690-691.

[3] Weiner AS， Boyarskikh UA， Voronina EN，et al. Methylenetetrahydrofolate reductase C677T and methionine synthase A2756G polymorphisms influence on leukocyte genomic DNA methylation level[J]. Gene，2014，533（1）：168-172.

[4] 李軍，史海龍，帖紅莉，等. MTHFR基因多態性檢測在神經管缺陷干預中的應用[J]. 中國優生優育，2008，14（4）：163-164.

[5] 賀憲民，張群，楊琦，等. 亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態性研究[J]. 中國計劃生育學雜志，2010，18（1）：13-18.

[6] 沈立萍，仇小強. 亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性、葉酸、同型半胱氨酸與神經管缺陷的關系[J]. 中華流行病學雜志，2004，25（10）：908-910.

[7] Liu R， Geng P， Ma M， et al. MTHFR C677T polymorphism and migraine risk： A meta-analysis[J]. J Neurol Sci，2013，10： 8.

[8] 周媛，王莉，張軍，等. 亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與先天神經管缺陷的關系[J]. 中國婦幼保健，2008， 23（22）：3105-3107.

[9] 盧慶彬，王志萍，宮蕊，等. 孕育神經管缺陷兒的育齡婦女生命質量及相關因素[J]. 中國心理衛生雜志，2011， 25（3）：185-190.

[10] 馬辰凱，江峰，孫蓮萍，等. 亞甲基四氫葉酸脫氫酶G1958A多態性與神經管缺陷易感性的meta分析[J]. 臨床兒科雜志，2013，（6）：565-569.

[11] 李桂華. 加強農村育齡婦女增補葉酸管理預防神經管缺陷[J]. 中國醫藥導報，2013，10（2）：119-121，125.

[12] 徐霞，陳盛強，謝芳英，等. 廣東漢族人N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與冠心病的關系初探[J]. 中國基層醫藥，2005，12（6）：661-662.

[13] 周世媛，周繼蘋，王莉娜，等. MTHFR基因多態性與法洛四聯癥的相關性研究[J]. 山東醫藥，2012，52（43）：1-3.

[14] 林茜，黃憶明. 孕婦維生素營養狀況對胎兒生長發育的影響[J]. 中國現代醫學雜志，2001，11（7）：50-51.

（收稿日期：2013-11-20）

表2 本地區早孕女性MTHFR基因的多態性位點遺傳平衡檢驗

2.2 MTHFR基因多態性與服用葉酸前后紅細胞葉酸濃度的相關性

本組早期孕婦干預前CT型平均紅細胞葉酸濃度（274.5±28.5）nmol/L，TT型平均紅細胞葉酸濃度（257.3±33.4）nmol/L，與CC型平均紅細胞葉酸濃度（297.2±31.3）nmol/L相比較，差異具有統計學意義（t1=8.152，P=0.015；t2=10.213，P=0.010）。口服400 μg葉酸1個月前后，CC型早孕受試者差異比較具有統計學意義（P<0.05），CT型、TT型差異無統計學意義（P>0.05）；口服800 μg葉酸1個月前后，CC型、CT型、TT型早孕受試者差異比較均具有統計學意義（P<0.05）。CC型早孕受試者口服400 μg葉酸1個月后平均紅細胞葉酸濃度與口服800 μg葉酸者相比較，差異無統計學意義（P>0.05）；CT型、TT型早孕受試者口服400 μg葉酸1個月后平均紅細胞葉酸濃度與口服800 μg葉酸者分別相比較，差異均具有統計學意義（P<0.05），詳見表3。

3 討論

神經管缺陷（neural tube defects，NTDs）是因神經管上皮的早期發生及分化紊亂而導致的一種最常見且后果嚴重的出生缺陷畸形，包括脊柱裂、無腦兒、脊髓脊膜或腦膜膨出、顱脊柱裂等臨床類型，是引起自然流產、死胎、死產及新生兒死亡最重要因素[6]。目前NTDs發病機制尚不清楚，一般認為是環境與遺傳因素共同作用的結果，當前的研究熱點是NTDs與同型半胱氨酸代謝相關性；近年來葉酸代謝途徑中酶體系多態性與神經管缺陷發生相關性研究得到關注 [7]。

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（5，10-methyl-netetrahydrofolate，MTHFR）屬人同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）代謝途徑過程中的關鍵酶，其主要作用是催化5，10-亞甲基四氫葉酸經還原反應轉變5-甲基四氫葉酸的[8]。5-甲基四氫葉酸是葉酸的一種重要活性形式。而葉酸是蛋氨酸代謝中限速反應過程，5-甲基四氫葉酸可脫落活性甲基并轉給同型半胱氨酸（Hcy），生成蛋氨酸。葉酸過低，則會引起蛋氨酸合成量的減少，導致血中同型半胱氨酸（Hcy）積存過多，這在孕早期階段會干擾神經管的閉合，從而發生神經管缺陷性胎兒[9，10]。研究發現，MTHFR基因的C677T突變可導致的酶活性和熱敏感性降低，使身體對低葉酸水平的耐受范圍縮窄[11，12]。但是如果機體攝入大量的葉酸而且沒有其他半胱氨酸代謝酶缺陷存在時，由于酶活反應底物濃度增加，同樣可以維持正常的Hcy代謝，MTHFR基因的C677T突變則不會引起高Hcy血癥，但是葉酸攝入不足時，MTHFR基因突變則可導致高Hcy血癥[13]。

雖然MTHFR基因突變頻率存在明顯的地區、種族差異，但來自不同地區的大樣本數據研究均證實，母親C677T突變是導致NTD兒遺傳風險的高危因素，MTHFR基因C677T型為子代發生NTD的危險因素之一[14]。我們的研究結果表明，早期孕婦CT型、TT型紅細胞葉酸濃度相對較低，補充較大劑量（800 μg）葉酸時能夠有效地維持紅細胞葉酸濃度，常規劑量400 μg一定程度上不能滿足MTHFR基因C677T型突變孕婦的正常葉酸水平需求。

綜上所述，針對育齡婦女開展MTHFR基因多態性檢測，并用以指導孕期口服補充葉酸劑量的選擇，值得臨床進一步研究嘗試。

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[6] 沈立萍，仇小強. 亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性、葉酸、同型半胱氨酸與神經管缺陷的關系[J]. 中華流行病學雜志，2004，25（10）：908-910.

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[8] 周媛，王莉，張軍，等. 亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與先天神經管缺陷的關系[J]. 中國婦幼保健，2008， 23（22）：3105-3107.

[9] 盧慶彬，王志萍，宮蕊，等. 孕育神經管缺陷兒的育齡婦女生命質量及相關因素[J]. 中國心理衛生雜志，2011， 25（3）：185-190.

[10] 馬辰凱，江峰，孫蓮萍，等. 亞甲基四氫葉酸脫氫酶G1958A多態性與神經管缺陷易感性的meta分析[J]. 臨床兒科雜志，2013，（6）：565-569.

[11] 李桂華. 加強農村育齡婦女增補葉酸管理預防神經管缺陷[J]. 中國醫藥導報，2013，10（2）：119-121，125.

[12] 徐霞，陳盛強，謝芳英，等. 廣東漢族人N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與冠心病的關系初探[J]. 中國基層醫藥，2005，12（6）：661-662.

[13] 周世媛，周繼蘋，王莉娜，等. MTHFR基因多態性與法洛四聯癥的相關性研究[J]. 山東醫藥，2012，52（43）：1-3.

[14] 林茜，黃憶明. 孕婦維生素營養狀況對胎兒生長發育的影響[J]. 中國現代醫學雜志，2001，11（7）：50-51.

（收稿日期：2013-11-20）

表2 本地區早孕女性MTHFR基因的多態性位點遺傳平衡檢驗

2.2 MTHFR基因多態性與服用葉酸前后紅細胞葉酸濃度的相關性

本組早期孕婦干預前CT型平均紅細胞葉酸濃度（274.5±28.5）nmol/L，TT型平均紅細胞葉酸濃度（257.3±33.4）nmol/L，與CC型平均紅細胞葉酸濃度（297.2±31.3）nmol/L相比較，差異具有統計學意義（t1=8.152，P=0.015；t2=10.213，P=0.010）。口服400 μg葉酸1個月前后，CC型早孕受試者差異比較具有統計學意義（P<0.05），CT型、TT型差異無統計學意義（P>0.05）；口服800 μg葉酸1個月前后，CC型、CT型、TT型早孕受試者差異比較均具有統計學意義（P<0.05）。CC型早孕受試者口服400 μg葉酸1個月后平均紅細胞葉酸濃度與口服800 μg葉酸者相比較，差異無統計學意義（P>0.05）；CT型、TT型早孕受試者口服400 μg葉酸1個月后平均紅細胞葉酸濃度與口服800 μg葉酸者分別相比較，差異均具有統計學意義（P<0.05），詳見表3。

3 討論

神經管缺陷（neural tube defects，NTDs）是因神經管上皮的早期發生及分化紊亂而導致的一種最常見且后果嚴重的出生缺陷畸形，包括脊柱裂、無腦兒、脊髓脊膜或腦膜膨出、顱脊柱裂等臨床類型，是引起自然流產、死胎、死產及新生兒死亡最重要因素[6]。目前NTDs發病機制尚不清楚，一般認為是環境與遺傳因素共同作用的結果，當前的研究熱點是NTDs與同型半胱氨酸代謝相關性；近年來葉酸代謝途徑中酶體系多態性與神經管缺陷發生相關性研究得到關注 [7]。

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（5，10-methyl-netetrahydrofolate，MTHFR）屬人同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）代謝途徑過程中的關鍵酶，其主要作用是催化5，10-亞甲基四氫葉酸經還原反應轉變5-甲基四氫葉酸的[8]。5-甲基四氫葉酸是葉酸的一種重要活性形式。而葉酸是蛋氨酸代謝中限速反應過程，5-甲基四氫葉酸可脫落活性甲基并轉給同型半胱氨酸（Hcy），生成蛋氨酸。葉酸過低，則會引起蛋氨酸合成量的減少，導致血中同型半胱氨酸（Hcy）積存過多，這在孕早期階段會干擾神經管的閉合，從而發生神經管缺陷性胎兒[9，10]。研究發現，MTHFR基因的C677T突變可導致的酶活性和熱敏感性降低，使身體對低葉酸水平的耐受范圍縮窄[11，12]。但是如果機體攝入大量的葉酸而且沒有其他半胱氨酸代謝酶缺陷存在時，由于酶活反應底物濃度增加，同樣可以維持正常的Hcy代謝，MTHFR基因的C677T突變則不會引起高Hcy血癥，但是葉酸攝入不足時，MTHFR基因突變則可導致高Hcy血癥[13]。

雖然MTHFR基因突變頻率存在明顯的地區、種族差異，但來自不同地區的大樣本數據研究均證實，母親C677T突變是導致NTD兒遺傳風險的高危因素，MTHFR基因C677T型為子代發生NTD的危險因素之一[14]。我們的研究結果表明，早期孕婦CT型、TT型紅細胞葉酸濃度相對較低，補充較大劑量（800 μg）葉酸時能夠有效地維持紅細胞葉酸濃度，常規劑量400 μg一定程度上不能滿足MTHFR基因C677T型突變孕婦的正常葉酸水平需求。

綜上所述，針對育齡婦女開展MTHFR基因多態性檢測，并用以指導孕期口服補充葉酸劑量的選擇，值得臨床進一步研究嘗試。

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[6] 沈立萍，仇小強. 亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性、葉酸、同型半胱氨酸與神經管缺陷的關系[J]. 中華流行病學雜志，2004，25（10）：908-910.

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[8] 周媛，王莉，張軍，等. 亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與先天神經管缺陷的關系[J]. 中國婦幼保健，2008， 23（22）：3105-3107.

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[10] 馬辰凱，江峰，孫蓮萍，等. 亞甲基四氫葉酸脫氫酶G1958A多態性與神經管缺陷易感性的meta分析[J]. 臨床兒科雜志，2013，（6）：565-569.

[11] 李桂華. 加強農村育齡婦女增補葉酸管理預防神經管缺陷[J]. 中國醫藥導報，2013，10（2）：119-121，125.

[12] 徐霞，陳盛強，謝芳英，等. 廣東漢族人N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與冠心病的關系初探[J]. 中國基層醫藥，2005，12（6）：661-662.

[13] 周世媛，周繼蘋，王莉娜，等. MTHFR基因多態性與法洛四聯癥的相關性研究[J]. 山東醫藥，2012，52（43）：1-3.

[14] 林茜，黃憶明. 孕婦維生素營養狀況對胎兒生長發育的影響[J]. 中國現代醫學雜志，2001，11（7）：50-51.

（收稿日期：2013-11-20）