UPLC-IDMS法測定配方奶粉中的生物素含量

梁敏慧，崔亞娟*，葉 潤，李 全霞，陳兆天，李菁菁，李 東

（1.北京工業大學生命科學與生物工程學院，北京 100124；2.北京市營養源研究所，北京 100069）

UPLC-IDMS法測定配方奶粉中的生物素含量

梁敏慧1，崔亞娟2,*，葉 潤2，李 全霞2，陳兆天2，李菁菁2，李 東2

（1.北京工業大學生命科學與生物工程學院，北京 100124；2.北京市營養源研究所，北京 100069）

建立一種超高效液相色譜-同位素稀釋質譜法測定配方奶粉中生物素含量的方法。樣品中加入生物素-D2作為同位素內標，經水超聲提取后，以含體積分數0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸銨溶液和乙腈作為流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧正離子模式、多反應監測方式進行定性定量分析。結果表明：生物素在1～50 ng/mL范圍內線性關系良好，線性范圍內對已知生物素含量樣品3 個標準添加水平的平均回收率為89.6%～93.1%，相對標準偏差為1.71%～4.33%。方法檢出限為0.6 μg/100 g，定量限為1.5 μg/100 g，該方法具有靈敏度高、重復性好、分析時間短等優點，可以滿足配方奶粉中生物素含量的測定要求。

生物素；超高效液相色譜-同位素稀釋質譜；奶粉

生物素又叫做VB7，是一種水溶性B族維生素。生物素是構成羧化酶的重要輔酶[1]，參與人體內脂肪、糖類和氨基酸的代謝[2]，對于維持機體正常生理功能有重要的作用。其長期攝入不足會導致免疫、代謝、基因表達方面的疾病[3-7]。配方奶粉是嬰幼兒除母乳外主要的營養來源，因此對其中生物素的檢測監督是十分必要的。

目前，配方奶粉中生物素的測定方法主要是微生物法[8-10]。微生物法也是我國分析嬰幼兒食品和乳品中生物素的國標分析方法，其檢測靈敏度高，但是實驗周期長、重復性差，對實驗操作環境有比較嚴格的要求。其他常用于生物素檢測的分析方法還包括生物傳感器法、酶聯免疫法、高效液相色譜法[1,11-12]等。超高效液相色譜-同位素稀釋質譜（ultra performance liquid chromatographyisotope dilution mass spectrometry，UPLC-IDMS）技術是一種新型的儀器分析手段，它將色譜良好的分離能力與質譜的高選擇性結合起來，具有靈敏性高、選擇性好、分析速度快并且分析結果準確等優點，近年來在食品分析中得到了廣泛的應用[13-14]。而同位素稀釋技術[15-16]通過加入穩定同位素標記物，可有效消除基質效應及處理過程帶來的較大偏差，盡可能保證了分析結果的準確性。近年來，國內已有報道利用高效液相色譜-質譜法測定配方奶粉中的生物素[17-19]，但采用同位素稀釋法分析測定奶粉中生物素含量的方法尚未見報道。

本實驗采用可以抵消樣品處理過程中損失的同位素稀釋質譜法，同時結合UPLC-串聯質譜良好的分離能力及高選擇性，對配方奶粉中的生物素進行了定性和定量分析，建立一種結果準確、分析速度快、樣品處理簡單的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

配方奶粉樣品（樣品A～E、a～e） 市購。

生物素標準品（純度≥98.0%） 美國Supelco公司；生物素-D2標準品（純度≥99.5%） 美國Iso Sciences公司；乙酸銨、甲酸（均為色譜純） 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；硫酸、鹽酸（均為分析純） 北京化學試劑廠；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

Acquity＠UPLC-Xevo TQ型超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀 美國Waters公司；BS224S型分析天平德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 標準儲備液配制

生物素標準儲備溶液（100 μg/mL）：精確稱取生物素1.0 mg，用體積分數50%甲醇溶液溶解至10 mL，搖勻，密封、避光保存。生物素-D2標準儲備溶液（100 μg/mL）：稱取生物素-D21.0 mg，用體積分數50%甲醇溶液溶解至10 mL，搖勻，密封、避光保存。臨用前根據需要用水稀釋成不同質量濃度的標準溶液。

1.3.2 樣品處理條件的優化

根據現有文獻[20-21]和標準[22]選取奶粉經0.5 mol/L硫酸、1.0 mol/L鹽酸溶解后在121 ℃，1 MPa條件下水解30 min和水溶解后超聲10 min作為樣品提取方法，考察不同提取方法的提取效果。并通過實驗比較三氯甲烷、調pH值、乙腈和高氯酸去除蛋白質的效果。

確定樣品處理方法后稱取奶粉樣品7 g（精確至0.000 1 g）于50 mL錐形瓶中，加入與樣品中生物素含量相近的生物素-D2標準儲備液；瓶中加入30 mL溫水振搖溶解后，超聲提取10 min。冷卻至室溫，用5 mol/L硫酸調pH值到1.7，再用10 mol/L氫氧化鈉溶液調pH值到4.6，溶液轉移到100 mL容量瓶中，用水沖洗3 次，合并溶液于容量瓶中，定容混勻后過濾，濾液過0.2 μm聚丙烯濾膜濾膜，待上機分析。

1.3.3 色譜條件優化

色譜柱：實驗比較BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Acquity＠HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）分離效果的差異；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；流動相A：含體積分數0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸銨水溶液；流動相B：乙腈。梯度洗脫，洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件Table1 Elution conditions of mobile phase

1.3.4 質譜條件優化

電噴霧離子源正離子模式；多反應監測；毛細管電壓3 000 V；離子源溫度150 ℃；去溶劑氣溫度500 ℃；去溶劑氣流速（氮氣）1 000 L/h；碰撞氣流速（氬氣）0.18 mL/min。

在電噴霧源正離子檢測方式下，生物素的準分子離子峰為[M+H]+峰。配制0.5 μg/mL的生物素標準溶液，調節各個參數得到響應較強的[M+H]+母離子峰。然后對母離子進行子離子掃描，調節碰撞能量，選擇響應較高的2 個子離子作為定性定量離子。2 個離子中響應高的作為定量離子，另一個作為定性離子。優化確定適合本實驗的質譜條件。

1.3.5 方法學實驗

1.3.5.1 線性范圍

準確吸取生物素標準儲備溶液，添加與試樣中生物素含量相近的生物素同位素內標溶液，用水配制成質量濃度為1、5、10、20、30、40、50 ng/mL的生物素標準溶液進行進樣分析，確定生物素的線性范圍。

1.3.5.2 檢出限與定量限

選擇木薯淀粉作為空白樣品（經測定不含生物素），對其進行不同水平的加標實驗，樣品進行前處理后，以RSN為3和RSN為10作為生物素的檢出限和定量限。

1.3.5.3 精密度與回收率

向已知生物素含量的奶粉樣品中分別添加3 個不同質量濃度的標準溶液進行回收率實驗，各個添加水平平行測定6 次，計算加標回收率和相對標準偏差，考察方法的精密度與回收率。

1.3.5.4 與微生物方法比對

選取5 種市購的配方奶粉（樣品A～E），每種樣品平均分成2 份，一份采用微生物法測定其中的生物素含量，另一份采用UPLC-IDMS測定其中的生物素含量，每份平行測定6 次，計算奶粉中生物素含量，通過2 種方法結果的比較驗證UPLC-IDMS方法的可行性與準確性。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件優化

表2 不同前處理方法結果Table2 Comparison of different sample pretreatment procedures

不同提取方法的提取效果見表2。結果顯示，3 種方法最終測定值并無顯著差異，都可以獲得較好的結果。但用水超聲提取處理樣品后，儀器峰面積響應值要比另外2 種方法高出很多，這可能是由于酸對生物素及其內標的離子抑制作用而導致了儀器響應值的顯著降低?？紤]到分析的準確性，選擇使用水超聲處理作為樣品的提取方法。

配方奶粉中含有大量的蛋白質存在降低生物素的離子化效率風險，從而影響分析的準確性，并縮短色譜柱的使用壽命[18]。實驗通過比較三氯甲烷、調pH值、乙腈和高氯酸去除蛋白質的效果，結果發現三氯甲烷、調pH值以及高氯酸法沉淀蛋白效果較好，可以獲得較為澄清的溶液，回收率均為90%以上。但考慮到色譜柱適合的pH值范圍以及不同樣品在水中的pH值差異會影響生物素在色譜柱上的保留時間，因此選擇調pH值法作為去除蛋白質的方法。

2.2 色譜條件優化

實驗中2 種色譜柱的分離效果差異見圖1。C18柱的保留時間比T3柱提前，2 種柱子對生物素都有良好的分離效果，但T3柱的響應值（6.28×106）要好于C18柱（3.24×106）的響應值，因此實驗選擇T3柱。

2.3 質譜條件優化

質譜條件優化后確定的生物素定性和定量離子對分別為m/z 245.1＞97.0和m/z 245.1＞227.0，生物素-D2的定性和定量離子對分別為m/z 247.1＞99.0和m/z 247.1＞229.0。生物素及其同位素的母離子、定量定性離子、錐孔電壓、碰撞能量等參數見表3。生物素及其同位素-D2的多反應監測色譜圖見圖2，子離子掃描圖見圖3。

表3 生物素及其同位素內標的質譜參數Table3 Instrumental parameters of biotin and biotin-D

圖2 生物素及生物素--DD2的多反應監測色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of biotin and biotin-D2

圖3 生物素和生物素--DD2的離子掃描質譜圖Fig.3 Mass spectra of biotin and biotin-D2

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍

以生物素與生物素內標峰面積比（A生物素/A生物素-D2）和同位素質量濃度的乘積為 縱坐標，生物素質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果如圖4所示。生物素在1～50 ng/mL范圍內，線性回歸方程為Y=1.826 97X+ 0.049 075 6，相關系數r大于0.999 8，線性關系良好，十分適合做定量分析。

圖4 生物素標準曲線Fig.4 The calibration curve of biotin

2.4.2 檢出限與定量限

以RSN為3作為檢出限，RSN為10作為定量限，得到方法的檢出限為0.4 ng/mL，定量限為1.0 ng/mL。當奶粉質量為7 g，定容體積為100 mL時，折算成奶粉含量分別為0.6 μg/100 g和1.5 μg/100 g，表明該方法可對生物素含量較少的奶粉樣品進行定性定量分析。

2.4.3 精密度與回收率

向奶粉樣品中分別添加3 個不同質量濃度的標準溶液進行回收率實驗，各個水平平行測定6次，計算加標回收率和相對標準偏差，結果見表4。生物素3 個水平的加標回收率在89.6%～93.1%，相對標準偏差在1.71%～4.33%，表明該方法比較準確，適用于奶粉中生物素的定性定量分析。

表4 生物素加標回收實驗結果Table4 Results of recovery and relative standard deviation

2.4.4 與微生物方法的比對

微生物法是我國測定嬰幼兒食品和乳品中生物素的國標分析方法。實驗比較了UPLC-IDMS法與微生物法之間的差異來驗證所建立方法的準確性。對5 種配方奶粉樣品同時做了2 種方法的比對實驗，檢測結果見表5。 利用SPSS軟件對實驗結果做非參數Mann-Whitney秩和檢驗，分析2 種方法測定結果之間差異是否顯著：得出P值為0.705（P＞0.05），表明2 種方法測定結果無顯著差異，證明了實驗建立的方法可以用于配方奶粉中生物素的檢測。

表5 微生物法和UPLC-IDMS法對照實驗Table 5 Comparison of microbiological method and UPLC-IDMS method

2.5 實際樣品測定結果

表6 配方奶粉中生物素UPLC-IDMS測定結果Table 6 Analytical results for milk powder samples by UPLC-IDMS

利用所建立的方法對市售的5 種配方奶粉（樣品a～e）進行測定，每個樣品平行測定3 次，計算平均值，結果見表6?？梢钥闯?，5 種配方奶粉中生物素含量均大于8 μg/100 g的，符合國家標準[23]。

3 結 論

本實驗建立了一種可以快速檢測配方奶粉中的生物素含量的方法。奶粉中生物素含量較低且基質復雜，通過加入同位素內標可消除實驗過程中基質效應的影響和處理過程生物素損失帶來的偏差，同時利用質譜的高選擇性，簡化了實驗步驟，獲得了穩定良好的測定結果。該方法操作過程簡單，分析周期短、靈敏度高、重復性好，適合奶粉中生物素的分析研究，必將受到廣泛的重視。

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Determination of Biotin in Milk Powder by Using Ultra Performance Liquid Chromatography-Isotope Dilution Mass Spectrometry

LIANG Minhui1, CUI Yajuan2,*, YE Run2, LI Quanxia2, CHEN Zhaotian2, LI Jingjing2, LI Dong2
(1. College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China; 2. Beijing Research Institute for Nutritional Resources, Beijing 100069, China)

An ultra performance liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry (UPLC-IDMS) method has been developed for the determination of biotin in milk powder. After spiking biotin-D2as an internal standard, samples were extracted with water. The mobile phase consisted of 10 mmol/L ammonium acetate with 0.1% f ormic acid and acetonitrile. The biotin was identified under multiple-reaction monitoring (MRM) mode and quantified by an internal standard method. The results showed a good linear calibration in the range of 1–50 ng/mL, the recoveries at three spiked levels and the relative standard deviations were 89.6%–93.1% and 1.71%–4.33%, respectively. T he limit of detection and quantification for biotin were 0.6 μg/100 g and 1.5 μg/100 g, respectively. This method is sensitive, time saving, and accurate for the determination of biotin in milk powder.

biotin; ultra performance liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry (UPLC-IDMS); milk powder

TS207.3

A

1002-6630（2015）04-0136-05

10.7506/spkx1002-6630-201504026

2014-07-02

北京市科委科技新星計劃項目（2011059）；衛生部行業科研專項（201202012）

梁敏慧（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品分析。E-mail：lmh29301126@163.com

*通信作者：崔亞娟（1979—），女，副研究員，博士，研究方向為食品分析。E-mail：cuiyj66@163.com