吐溫80體外溶血研究

賀煜星，丁選勝

（中國藥科大學臨床藥學教研室，江蘇 南京 210009）

吐溫80體外溶血研究

賀煜星，丁選勝

（中國藥科大學臨床藥學教研室，江蘇 南京 210009）

目的 考察吐溫80的體外溶血作用，為制劑生產和臨床安全用藥提供依據。方法 在570 nm波長下，采用紫外分光光度法評價吐溫80對家兔紅細胞的體外溶血作用。結果 吐溫80可引起家兔紅細胞體外溶血和紅細胞形態改變。結論 吐溫80具有一定的體外溶血性。

吐溫80；藥用輔料；溶血性

吐溫80（Tween 80，polyoxyethylene 80）又名聚山梨醇酯80，是一種聚氧乙烯衍生的非離子型表面活性劑，為藥物制劑中常用的輔料之一［1］。很多常用中藥注射劑有效成分是水難溶性物質，在成型工藝中一般多采用適量吐溫80作為增溶劑。近年來，國內外已有吐溫80作為增溶性藥用輔料引起不良反應的報道［2-4］，普遍認為其存在溶血性［5-6］。本文通過對吐溫 80體外溶血規律的研究，為吐溫80在注射劑中安全使用提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Multiskan_FC酶標儀（Thermo（中國）有限公司）；UV-1800紫外可見分光光度計（日本島津）；80-2型電動離心機（金壇市金城國勝實驗儀器廠）；HH-S型水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）；BI-2000醫學圖像分析系統（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 實驗動物 家兔 6只，雄性，體重 1.8～2.2 kg，普通級，由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供，動物生產許可證號：SCXK（蘇）2007-0008。

1.3 藥品 吐溫80（江蘇晨牌藥業集團股份有限公司，批號130824）；0.9%氯化鈉注射液（江蘇亞邦生緣藥業有限公司，批號1304802）。

2 方法

2.1 紅細胞懸液制備 6只家兔均從耳中動脈采血約6 mL，肝素抗凝，加適量0.9%氯化鈉注射液1 500 rpm離心15 min，棄去上清液，反復3～4次，至上清液呈無色透明為止。將所得紅細胞稀釋為5%紅細胞懸液，4℃保存，備用。

2.2 供試品溶液配制 精密量取吐溫80，用0.9%氯化鈉注射液配置成0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%濃度吐溫80溶液作為供試品溶液，備用。

2.3 最大吸收波長確定 取 5%紅細胞懸液 0.25 mL，加入蒸餾水 1 mL，混勻，于 37℃水浴孵育 30 min后，在200～800 nm波長范圍內進行 UV掃描，在570 nm處有最大吸收；同法分別將配置的0.1% ～2%吐溫80溶液進行掃描，結果顯示，各濃度的吐溫80溶液在570 nm波長處均無干擾吸收。

2.4 體外溶血實驗 取試管10支，分別編號 1～10號。1～8號管為樣品管，分別加入 1 mL 0.1% ～2%吐溫80溶液；9號管為陰性對照管，加入1 mL 0.9%氯化鈉注射液；10號管為陽性對照管，加入 1 mL蒸餾水。各管分別加入0.25 mL 5%紅細胞懸液，搖勻后置37℃水浴鍋中孵育。考察孵育 1、3和6 h的溶血情況。孵育后，輕震搖勻，置于光學顯微鏡下觀察紅細胞形態。各試管于1 500 rpm離心15 min［7］，取上清液測定吸光度（A），波長 570 nm，光徑1 cm。按照公式：溶血率（%）＝（A樣-A陰）／（A陽-A陰）×100%計算溶血率，其中A樣、A陰和 A陽分別為樣品管、陰性對照管和陽性對照管的吸光度。溶血率 ＞5%表明有溶血發生，平行觀察6只家兔。

3 結果

3.1 吐溫80體外溶血規律 吐溫 80溶液可引起家兔紅細胞體外溶血，且溶血率呈濃度和時間依賴性。體外孵育3 h和6 h，0.1%吐溫80溶液即可引起溶血率大于5%，即引起紅細胞溶血。隨吐溫80溶液濃度增大、孵育時間延長，溶血率呈增高趨勢。結果見表1、圖1。

表1 孵育1、3、6 h后家兔紅細胞溶血率（%，±s，n＝6）

表1 孵育1、3、6 h后家兔紅細胞溶血率（%，±s，n＝6）

注：與孵育1 h相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與孵育3 h相比，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

孵育時間吐溫80濃度／% 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.5 2 1 h -2.33±0.66 0.03±3.98 6.47±10.5 17.3±17.38 27.00±18.38 40.07±21.80 57.6±21.75 61.26±19.21 3 h 6.31±7.93*＃25.63±14.82**42.07±18.43**56.89±15.94**64.18±15.14**73.42±11.16**80.08±6.41* 84.49±3.40*6 h 14.48±9.03**45.02±15.47**＃74.97±6.78**＃78.58±8.14**＃82.73±7.68**＃86.32±6.22**＃87.51±5.70**＃89.61±3.78**＃

圖1 孵育1、3、6 h后家兔紅細胞溶血率曲線（%，±s，n＝6）

3.2 吐溫80致紅細胞形態變化觀察 家兔正常紅細胞形態呈雙面微凹之圓盤狀。孵育后，陰性管紅細胞形態與孵育前基本一致。低濃度吐溫 80溶液可引起紅細胞皺縮，并產生棘狀紅細胞。隨濃度升高，可見圓形紅細胞、變形紅細胞。高濃度吐溫 80溶液可致影泡狀紅細胞產生。結果見圖2。

4 討論

目前，《部頒中藥標準》收載的中藥注射劑注明添加的增溶劑全部為吐溫 80，使用量為 0.1%～2%［8］。實驗結果顯示，在該濃度范圍內，吐溫 80可引起家兔紅細胞溶血和紅細胞形變，且溶血率呈濃度和時間相關性增加。因此，在制劑生產中使用吐溫80作為增溶性輔料需注意其溶血性。

吐溫 80并非單一結構的純凈物質，而是由多種結構組成的同系混合物［9-10］，因此原料純度和雜質殘留可能與其溶血性相關。同時，吐溫 80作為增溶劑，在解決注射劑主要成分水溶性差的同時，有可能成為制劑發生溶血反應的因素之一。因此，深入進行吐溫80的溶血性研究，有助于建立其質量控制標準，在有效增溶的同時提高安全性，為中藥注射劑中吐溫80的合理使用提供依據。吐溫80的體內溶血過程與機制、藥物與輔料的相互作用等尚待進一步研究。

圖2 吐溫80孵育1、3、6 h后家兔紅細胞形態變化（光鏡，40×10）

［1］ Dahet CF，Baroody GM，Howland RJ.Effect of a surfactant，Tween 80，on the formation and secretion of chylomicrons in the rat［J］.Food Chem Toxicol，2003，41（4）：575-582.

［2］ Siderov J，Prasad P，De Boer R，et al.Safe administration of etoposide phosphate after hypersensitivity reaction to intravenous etoposide［J］.Br J Cancer，2002，86（1）：12-13.

［3］ 張廣求，王樹平.魚腥草注射液的溶血實驗［J］.時珍國醫國藥，2004，15（12）：812.

［4］ 朱碧君，李婷婷，周志良，等.參麥注射液中吐溫-80含量與溶血率的相關性試驗研究［J］.科技廣場，2010（10）：71-73.

［5］ 郭 琰，李貽奎，吳翠萍，等.6種不同來源的注射用聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯致敏性和溶血性實驗研究［J］.中國中藥雜志，2011，36（14）：1879-1883.

［6］ Chachra D，Coote JG，Parton R.Haemolytic and cytotoxic activities of the Tween 80-extracted putative haemolysin of Pasteurella multocidaB：2［J］.Veterinary Microbiology，2011（150）：331-337.

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［8］ 國家藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑［S］，1998：1-385.

［9］ U.S.Pharmacopeial Convention.United States Pharmacopeia［M］.34 ed.2011：1634-1636.

［10］Hewitt D，Alvarez M，Robinson K，et al.Mixed-mode and reversedphase liquid chromatography-tandem mass spectrometry methodologies to study composition and base hydrolysis of polysorbate 20 and 80［J］.J Chromatogr A，2011，1218（15）：2138-2145.

Study on the hemolysis of Tween 80 in vitro

HE Yu-xing，DING Xuan-sheng （Department of Clinical Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing，Jiangsu 210009，China）

Objective To investigate the hemolysis of tween 80 in vitro，providing the basis for preparation of production and safety of clinical medication.Methods To evaluate the hemolysis of tween 80 in vitro on rabbit erythrocytes by UV spectrophotometry at 570nm wave length.Results Tween 80 could cause hemolysis and morphological changes of rabbit erythrocytes in vitro.Conclusion Tween 80 can cause hemolysis in vitro.

Tween 80；pharmaceutical excipients；hemolysis

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.011

2014-01-05，

2014-01-28）

賀煜星，女，碩士研究生

丁選勝，男，副教授，碩士生導師，研究方向：臨床藥學，E-mail：dxs0162＠sina.com