新型ALG-g-Lys微膠珠的制備工藝優化

龍瑞敏，王士斌，陳宗香

（ 華僑大學化工學院，福建 廈門 361021）

新型ALG-g-Lys微膠珠的制備工藝優化

龍瑞敏，王士斌，陳宗香

（ 華僑大學化工學院，福建 廈門 361021）

為了提高海藻酸鈣膠珠的穩定性，采用海藻酸鹽的改性材料ALG-g-Lys制備微膠珠，通過單因素考察結合正交設計優化了ALG-g-Lys微膠珠的制備工藝。優化后的制備工藝為:ALG-g-Lys 濃度為15g/L，電壓為8.0kV，推進速度為30mm/h，針頭型號為24G，CaCl2濃度為15g/L。優化后制得的微膠珠粒徑均勻，球形度好，拖尾率、半球率和小球率小，平均粒徑為253±40μm。該工作提供了一種新型的載體材料替代海藻酸鹽作為凝膠材料，未來可適用于醫藥、食品行業等領域。

賴氨酸接枝海藻酸鹽；微膠珠；正交設計；優化

藥物的控制釋放也稱可控給藥體系，由于其對包埋的藥物或活性物質具有保護和控制釋放速率功能，近十多年來獲得了廣泛的研究與發展。載體材料的選擇是其中研究的一個熱點，當前使用的載體材料主要包括天然、半合成和合成高分子三大類，其中海藻酸鹽是一種天然的水凝膠高分子材料，由于其遇Ca2+、Ba2+等二價陽離子具有瞬時凝膠化的特點，一直受到研究者的親睞[1-3]。

然而海藻酸鈣水凝膠遇到螯合化合物（磷酸鹽、檸檬酸鹽）、非凝膠化離子（鈉離子、鎂離子）或溶液pH值變化時，海藻酸鈣凝膠中的鈣離子易被置換或發生溶脹，從而使凝膠逐漸轉變為液體而產生膨脹破裂的趨勢[4-5]。因此，為了提高海藻酸鈣膠珠的穩定性，改善藥物控制釋放的效果，目前研究者主要采取以下兩種解決思路。

一是利用其陰離子特性，在膠珠外層裹上一層陽離子聚合物薄膜或層層自組裝形成多層薄膜，該聚合物膜具有穩定海藻酸鈣膠珠及調節藥物控制釋放的功能。當前采用的成膜材料很多，包括聚氨基酸材料[6-8]、殼聚糖[9-10]、聚亞基二胍氯化氫[11]等。

另一個思路則是直接改造基體，將海藻酸鈉進行改性，引入新的功能基團，利用海藻酸高分子鏈間纏結和交聯劑與新官能團的相互作用來穩定水凝膠體系，如海藻酸鈉的雙丙酮丙烯酰胺[12]等。

本工作則采用基體改造思路，利用新的合成材料——賴氨酸接枝海藻酸鹽（ALG-g-Lys）材料替代海藻酸鹽。ALG-g-Lys分子鏈上剩余有較多的自由羧基，可以與Ca2+快速形成“蛋格”結構而凝膠化。利用該特性可將ALG-g-Lys溶液經注射泵推進，在高壓電場中噴射入CaCl2溶液中，快速形成微米級的膠珠。考察了制備條件（ALG-g-Lys濃度、電壓、針頭內徑、注射泵推進速度、不同溶劑、CaCl2濃度）對微膠珠形成的影響，以期提供一種新的載體形式。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

賴氨酸接枝海藻酸鹽（ALG-g-Lys，Mw660000，實驗室合成）；無水氯化鈣、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，均為分析純，購自汕頭市西隴化工廠有限公司。

BS210S電子分析天平（德國Sartorius）；TG2671CS高壓靜電裝置（廈門賽賢電子科技公司）；HI8424C pH計（北京哈納科儀科技公司）；XSP-3C生物顯微鏡（上海尚光顯微鏡有限公司）。

1.2 單因素考察微膠珠制備工藝

采用高壓靜電裝置制備Ca2+凝膠化的ALG-g-Lys膠珠，并用單因素法考察膠珠制備的影響因素，分別從ALG-g-Lys濃度、電壓、針頭內徑、注射泵推進速度、不同溶劑的不同水平來考察，以膠珠的球形度和平均粒徑為主要的考察指標。從單因素結果選定對高壓靜電法制備的膠珠有影響的因素及相應的水平，利用正交實驗進行優化，得到制備膠珠的最佳參數。

高壓靜電制備膠珠的過程可參考文獻[13-15]，基本條件：電壓9kV，推進速度30mm/h，針頭與液面距20mm，針頭型號為23G針頭（對應針頭內徑0.39mm），ALG-g-Lys濃度15g/L，CaCl2濃度20g/L。

1.3 正交設計優化微膠珠制備工藝

正交實驗中固定溶解ALG-g-Lys的溶劑為pH 值7.4的PBS緩沖液，針頭距液面的距離為20mm，正交實驗以ALG-g-Lys濃度、電壓、推進速度、針頭型號和CaCl2濃度作為因素設計L16（45）的正交實驗。

優化考察指標為平均粒徑、拖尾率、半球率和小球率。

1.4 驗證實驗

根據正交實驗分析結果選取最優實驗參數實驗并分析。測定不少于500個的粒徑，計算算數平均粒徑d。

其中，n1、n2、···、nn為式中為具有粒徑d1、d2、···、dn的粒子數。

將所測得的粒徑分布數據，以粒徑為橫坐標，以頻率（每一粒徑范圍的粒子個數除以粒子總數所得的百分率）為縱坐標作圖可得粒徑分布直方圖；以各粒徑范圍的頻率對各粒徑范圍的平均值作圖可得粒徑分布曲線。

2 結果與討論

2.1 單因素結果分析

2.1.1 ALG-g-Lys濃度的影響

當ALG-g-Lys濃度小于16g/L時（包括16g/L），膠珠表面均較光滑；當ALG-g-Lys濃度大于16g/L時，膠珠表面較為粗糙。因溶解ALG-g-Lys的溶劑是磷酸鹽緩沖液，而Ca2+會與一定濃度的磷酸根離子形成水不溶的物資，隨著ALG-g-Lys濃度的增大，凝膠的網格結構變致密，致使所形成的沉淀包于膠珠內部或附于膠珠表面，因而膠珠表面粗糙。當ALG-g-Lys濃度為14g/L時，膠珠大小較為均勻，且球形度較好，幾乎沒有拖尾變形。

由圖1可見，不同ALG-g-Lys濃度制出的膠珠粒徑各不相同；當ALG-g-Lys濃度為14g/L時膠珠粒徑最小；當ALG-g-Lys濃度小于14g/L時，膠珠粒徑隨濃度的增大而減小；當ALG-g-Lys濃度大于14g/L時，膠珠粒徑隨濃度的增大而增大。可能是因為ALG-g-Lys濃度增大，導致溶液的密度增大，在電場作用下，被拉扯出來形成膠珠的量增多，致使膠珠的粒徑增大。綜上，當ALG-g-Lys濃度為14g/L時，制出的膠珠粒徑較小且球形度較好，表面光滑。

2.1.2 電壓的影響

由圖2可以看出，在電壓為8.0kV的條件下，膠珠粒徑最小。當電壓小于8.0kV時，膠珠粒徑隨著電壓的增大而減小；當電壓大于8.0kV時，膠珠粒徑變化不大。分析認為，當電壓較低時，其產生的電場作用力還不足以完全克服溶液的黏滯力和表面張力，所以形成的膠珠的直徑較大；隨著電壓的升高，電場作用力增大，制得的膠珠直徑就相應減小；而當電壓大到某一個值后（8.0kV），膠珠粒徑趨于平穩，此時電場力已經難以克服更大的表面張力制備更小粒徑膠珠，因而電場場強的增大對膠珠的平均粒徑沒有顯著的影響。

圖1 不同ALG-g-Lys濃度微膠珠粒徑折線圖

圖2 不同電壓條件下微膠珠粒徑折線圖

2.1.3 針頭型號的影響

針頭型號為23G時，膠珠大小不一，有拖尾現象；針頭型號為24G時，大膠珠較均勻，小微粒較少，拖尾也較少；針頭型號為25G時，膠珠拖尾較多，且形狀不規則的較多；針頭型號為26G時，膠珠形狀不規則的較多，且小微粒的數目較多。

由圖3可以看出，針頭型號為23G的膠珠粒徑最大，26G的膠珠粒徑最小，總體趨勢隨著針頭內徑的減小，膠珠粒徑也減小。綜合膠珠形貌與粒徑結果分析，針頭型號為24G時，滴制出的微球較理想。

2.1.4 推進速度的影響

注射泵推進速度為10mm/h的膠珠形狀非常不規則且大小非常不均一；注射泵推進速度為20mm/h的膠珠大小不均勻且有部分拖尾變形；注射泵推進速度為30mm/h的膠珠大球較均勻，小球較少，拖尾也較少；注射泵推進速度為40mm/h的膠珠形狀不規則，但小球較少；注射泵推進速度為50mm/h的膠珠形狀不規則，大小不均一；注射泵推進速度為60mm/h的膠珠拖尾較多，但小球較少。由圖4可以看出，注射泵推進速度小于30mm/h時（包括30mm/h），膠珠粒徑幾乎沒有變化；當注射泵推進速度大于30mm/h時，膠珠粒徑相差較大。這是因為推進速度提高，溶液向針尖的流速增大，形成膠珠的速度增加，能夠形成較大的膠珠，而且，在溶液壓力和電場力的作用下膠珠容易脫落，因而制成的膠珠均勻性好，提高推進速度，有利于提高生產效率和膠珠的均勻性，但這也會使膠珠直徑增大。綜上可以得出，當注射泵推進速度為30mm/h時，滴制出來的膠珠較理想。

圖3 不同針頭內徑微膠珠粒徑折線圖

圖4 不同注射泵推進速度的微膠珠粒徑折線圖

2.1.5 溶劑的影響

溶劑為溶解ALG-g-Lys的磷酸鹽緩沖液。pH值為5.0時，膠珠大小不均，有極少部分變形；pH值為5.6時，膠珠大小不均，有多數拖尾；pH值為6.8時，膠珠大小相對較均勻，但是存在許多粒徑極小的膠珠；pH值為7.4時，膠珠大小均勻，球形度好。

圖5 不同溶劑條件下微球粒徑折線圖

由圖5可以看出，當溶劑為pH 值7.4的磷酸鹽緩沖液時，膠珠粒徑最小；當溶劑為pH 值6.8的磷酸鹽緩沖液時，膠珠粒徑最大；當溶劑pH值在5.0～5.6時，膠珠粒徑變化不大；當6.87.4時，膠珠粒徑隨pH值的增大而增大。綜上可以看出，溶劑pH值 7.4的磷酸鹽緩沖液時，滴制出的膠珠較理想。

2.2 正交設計優化結果分析及驗證實驗

正交設計優化結果分析如表1所示。按照所得粒徑的平均值為考察指標，如果希望獲得粒徑小的微膠珠，所得最優組合為：a1b2c2d3e1。根據極差來判斷，各因素的影響效果為：c>a>d>b>e；按照拖尾率的平均值為考察指標，拖尾率越小越好，所得最優組合為：a1b2c3d2e4，根據極差來判斷，各因素的影響效果為：c>d>a>b>e；按照半球率的平均值為考察指標，半球率越小越好，所得最優組合為：a4b3c4d4e3，根據極差來判斷，各因素的影響效果為：d>a>c>e>b；按照小球率的平均值為考察指標，小球率越小膠珠越均勻，所得最優組合為：a2b1c3d2e3，根據極差來判斷，各因素的影響效果為：a>d>b>c>e。

綜合分析得出最優組合：a2b1c3d2e3或a2b2c3d2e3；依次進行驗證實驗，得實驗結果如下。

（1）a2b1c3d2e3組合，即為ALG-g-Lys 濃度為15g/L，電壓為7.5kV，推進速度為30mm/h，針頭型號為24G，CaCl2濃度為15g/L，所得膠珠半球很多。

（2）a2b2c3d2e3組合，即為ALG-g-Lys 濃度為15g/L，電壓為8.0kV，推進速度為30mm/h，針頭型號為24G，CaCl2濃度為15g/L。所得膠珠形貌由圖6可以看出，膠珠大小均勻，結構圓整，極少數拖尾變形。平均粒徑為253±40μm（圖7），其中在320～340μm的膠珠數較多，導致粒徑分布曲線較不對稱。擬合方程為：Y=0.02116+0.2617exp[-0.5× (X-245.96225)/21.45503]2，R2=0.85505。可能是因為注射泵是間歇性工作的，導致推進壓力不均勻，通過針頭的溶液不均勻，使膠珠的粒徑在320～340μm有一定數目的膠珠，這部分膠珠可能為間歇過程中滴出的，因為注射泵間歇時，溶液所受的壓力減小，克服黏滯阻力的合力減小，因而膠珠粒徑增大。

圖6 優化后微膠珠光鏡照片

圖7 粒徑分布直方圖和正態擬合曲線

3 結 論

采用海藻酸鹽的改性材料ALG-g-Lys制備微膠珠，通過單因素考察結合正交設計優化了ALG-g-Lys微膠珠的制備工藝，所制得的微膠珠粒徑均勻，結構圓整，拖尾率、半球率和小球率小，平均粒徑為253±40μm。該載體材料可生物降解，其中海藻酸鹽為多糖，降解產物可參與人體自身循環；賴氨酸為人體必需氨基酸，兼具營養作用與藥理功效。該工作提供了一種新型的載體材料替代海藻酸鹽作為凝膠材料，未來可適用于醫藥、食品行業等領域。

表1 正交設計實驗結果分析表

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Preparation optimization of novel ALG-g-Lys micro-beads

LONG Ruimin，WANG Shibin，CHEN Zongxiang
（School of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，Fujian，China）

A new material，ALG-g-Lys，was used to prepare micro-beads instead of alginate to improve the stability of alginate micro-beads. The preparation process was optimized using the single factor method combined with orthogonal design. The optimized parameters were:ALG-g-Lys concentration 1.5g/L，voltage 8.0kV，advance speed 30mm/h，needle 24G，and CaCl2concentration 15g/L. The prepared micro-beads showed even distribution and good sphericity with low trailing ratio，half sphere ratio and globule ratio. The mean particle size was 253±40μm. This work supplies a novel carrier material instead of alginate to prepare gel，showing bright future in medicine and food industries.

lysine grafted alginate；micro-bead；orthogonal design；optimization

R 318

A

1000-6613（2014）09-2403-06

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.09.028

2014-01-03；修改稿日期：2014-01-17。

國家自然科學基金（31000441、31170939）、福建省自然科學基金（2013J01189）及華僑大學校級科研基金（10HZR10）項目。

及聯系人：龍瑞敏（1979—），女，實驗師，主要從事生物化工相關研究。E-mail simplever@126.com。