改良瑞-姬氏染色法的染色效果研究

沈興婭 張好為 趙廣明 魏賀璽 楊立順

改良瑞-姬氏染色法的染色效果研究

沈興婭 張好為 趙廣明 魏賀璽 楊立順

目的 研究改良瑞-姬氏染色法的染色效果。方法采用傳統與改良瑞-姬氏染色法對40例精液標本進行染色，觀察改良瑞-姬氏染色對精子、精液細胞及陰道分泌物的染色效果。結果改良瑞-姬氏染色下的中段缺陷精子率[（7.02±2.4）％vs（5.48±2.8）％]及尾部缺陷精子率[（11.02±2.03）％vs 8.05±2.56）％]高于傳統的瑞-姬氏染色（P＜0.05）。兩方法的正常形態精子率及頭部缺陷精子率的比較差異無統計學意義。但是染色效果不同，改良方法下精子可見明顯頭核的深染和頂體的突出，而傳統方法染色效果較模糊。改良瑞-姬氏染色下的精液細胞及陰道分泌物中細胞及滴蟲等成分染色效果良好，陰道毛滴蟲的鞭毛和軸柱結構尤其清晰。結論改良瑞-姬氏染色法染色過程簡單、效果好、實用，值得臨床推廣應用。

精子；陰道涂片；毛滴蟲,陰道；染色與標記；改良瑞-姬氏染色法

目前，用臨床常用的瑞氏染色和瑞-姬氏染色進行精子染色的效果均不是很理想。黃宇峰等[1]采用經過洗滌3遍后的精子再進行傳統瑞-姬氏染色，能夠觀察到較理想的精子形態，但由于操作煩瑣、用時較長，在洗滌過程中會損失部分尾部缺陷的精子，又不適用于不液化精液。本研究對瑞-姬氏染色進行改良后用于精液染色，在標本處理上直接涂片染色無需洗滌，節約了時間；在試劑配置上調整了緩沖液的pH值，優化了染色程序，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 40份精液標本來源于2010年3月—8月在我院泌尿生殖科做常規精液檢查的患者，陰道分泌物來源于本院婦科門診。

1.2 試劑配置 瑞氏染液：瑞氏染料1 g，加入500 mL甲醇溶液中，倒置混勻后，放置37℃培養箱內，每天倒置混勻2次，1周即可使用。吉姆薩染液：吉姆薩染料0.5 g，置于33 mL甘油中，60℃水浴2 h使其溶解，再加60℃預熱的甲醇33 mL混合后置棕色瓶內，室溫下放置數日后方能使用。緩沖液：傳統瑞-姬氏染色用pH 6.9磷酸鹽緩沖液。改良瑞-姬氏染色用pH7.0磷酸鹽緩沖液，0.1 mol/L KH2PO430 mL+0.1 mol/L Na2HPO470 mL，混勻。

1.3 方法 每份精液標本制作涂片2張，分別按照傳統和改良瑞-姬氏染色法進行染色，由本科室經過培訓的2名技師，進行WHO推薦的精子形態學分類（多重精子缺陷指數），要求至少計數200個精子，互相復檢取均值。陰道分泌物只采用改良瑞-姬氏染色法進行染色并鏡檢。

1.3.1 改良瑞-姬氏染色法 將精液或分泌物涂片放在染色架上，滴加瑞氏染液5滴，加pH7.0磷酸鹽緩沖液10滴，混勻，再加吉姆薩染液2滴，輕輕搖動2 min，染色20 min。流水緩慢沖洗1 min，放入95％乙醇中1 s，脫掉浮色，流水緩慢沖洗1 min。待干，加中性樹膠，用50 mm×24 mm蓋玻片封片，置光鏡油鏡下進行形態學分析。

1.3.2 傳統瑞-姬氏染色法 參照文獻[2]中的方法對精液進行傳統瑞-姬氏染色。

1.4 統計學方法 應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，以均數±標準差（±s）表示，均數間比較用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種染色方法對精子染色形態的評估 改良瑞-姬氏染色法下的中段缺陷精子率和尾部缺陷精子率高于傳統瑞-姬氏染色（P＜0.05），但兩種方法的正常形態精子率和頭部缺陷精子率差異均無統計學意義，見表1。

Tab.1 Morphological evaluation of sperm stained by two methods表1 兩種染色方法對精子形態的評估 (n=40，％，±s)

Tab.1 Morphological evaluation of sperm stained by two methods表1 兩種染色方法對精子形態的評估 (n=40，％，±s)

＊P＜0.05

方法改良瑞-姬氏染色法傳統瑞-姬氏染色法t正常形態精子率25.2±5.4 25.5±4.6 0.51頭部缺陷精子率72.4±8.9 71.3±10.6 0.63中段缺陷精子率7.02±2.4 5.48±2.8 4.58＊尾部缺陷精子率11.02±2.03 8.05±2.56 6.21＊

2.2 兩種染色方法對同一份精液進行染色的效果 改良瑞-姬氏染色下的正常形態精子，精子頭核及頂體清晰，隱約可見赤道板，精子中段較尾部稍粗，可見中段小節，并可清晰看出尾部末梢，見圖1A。傳統瑞-姬氏染色所示精子中段和尾部幾乎不能著色，圖1B。

2.3 改良瑞-姬氏染色下的缺陷精子觀察 對于缺陷精子，改良瑞-姬氏染色也能獲得很好的染色效果，見圖2。

2.4 改良瑞-姬氏染色下的精液細胞 改良瑞-姬氏染色各階段生精細胞核染色質、核膜、胞漿和細胞膜均染色清晰，見圖3。

2.5 改良瑞-姬氏染色下的陰道分泌物涂片結果 改良瑞-姬氏染色對陰道分泌物中的白細胞、白色念珠菌（菌絲和孢子）、陰道毛滴蟲及線索細胞都有很好的染色效果，見圖4～6。

3 討論

3.1 2種方法對精子形態的評估 改良的瑞-姬氏染色法對精子的中段和尾部著色清晰，可見中段小結。缺陷精子的檢出率高于傳統的瑞-姬氏染色，這一結果和石亮等[3]的研究結果一致。雖然2種方法的頭部缺陷精子率無明顯差異，但染色效果不同，改良方法下可見明顯頭核的深染和頂體的突出，而傳統方法染色效果較模糊。

3.2 改良瑞-姬氏染色對陰道分泌物的著色 臨床實驗室對陰道分泌物的檢測有直接涂片鏡檢法及染色鏡檢法，采用的染色方法有革蘭染色、瑞氏染色、瑞-姬氏染色等。研究發現染色檢出的滴蟲、真菌、線索細胞陽性率明顯高于懸滴法[4]。本研究發現改良瑞-姬氏染色法對陰道分泌物中的滴蟲、真菌、桿菌、球菌、線索細胞都有很好的染色效果，尤其是陰道毛滴蟲的軸柱和鞭毛清晰可見，與蘇水蓮等[5]對陰道毛滴蟲的染色相比，本研究的方法著色力好，染色時間短。

3.3 改良瑞-姬氏染色法著色力強的原因分析 精子染色方法的基本原理是染料中帶正電荷的堿性染料與帶負電荷的核酸相結合使精子細胞核染色，酸性染料則將胞漿中帶相反電荷的蛋白質染色[6]。改良瑞-姬氏染色法著色力強的原因首先是程序的優化，其先混和瑞氏染液和緩沖液，緩沖液不僅提供了合適的pH環境，還起到稀釋的作用，使瑞氏染料滲透到細胞內而加速核的著色，使精子的頂體、頭核染色良好，后加姬氏染液染胞漿，使得精子的中段和尾部染色清晰。其次是緩沖液pH值的改變，通過多次試驗，緩沖液pH7.0的染色效果優于傳統的pH6.9。根據等離子狀態染色學說，適宜pH值的染浴條件，保證細胞大部分成分處于等電點附近著色是至關重要的。而精液pH值的正常范圍是7.2～8.0，pH7.0更接近精液的pH值。最后是染液比例的改變，傳統方法瑞氏染液與姬氏染液的染色比例是10∶1，而改良后比例為5∶2。改良法提高了染胞漿的姬氏染料，所以精子中段和尾部末梢染色良好，中段小結清晰可見。適宜的pH環境、適當的染液比例、優化的程序一起共同作用,使改良瑞-姬氏染色法的染色效果優于傳統瑞-姬氏染色法。

Fig.1 Sperm stainingusing Improved and traditional Wright-Giemsa staining(×1 918)圖1 改良和傳統瑞-姬氏染色下的精子（×1 918）

Fig.2 Defective sperm after Wright-Giemsa staining(×1 918)圖2 改良瑞-姬氏染色缺陷精子（×1 918）

Fig.3 different stages of spermatogenic cells Wright-Giemsa staining (×1 843)圖3 改良瑞-姬氏染色各階段生精細胞（×1 843）

Fig.4 The hypha and spore of Candida albicans(A)and Trichomonas vaginalis（B）(×1 918)圖4 白色念珠菌菌絲和孢子（A）及陰道毛滴蟲（B）（×1 918）

Fig.5 Lactobacilli(A)and sphaerita（B）(×1 918)圖5 乳酸桿菌（A）和球菌（B）（×1 918）

Fig.6 Clue cells(×1 918)圖6 線索細胞（×1 918）

[1]黃宇烽，印洪林.精液細胞學與超微結構圖譜[M].上海：第二軍醫大學出版社，2002：16.

[2]陸金春,黃宇烽,張紅燁.現代男科實驗室診斷[M].上海：第二軍醫大學出版社,2009:36-42.

[3]石亮，徐志鵬，孫超，等.人精子形態染色方法的比較[J].江蘇醫藥，2011,37（17）：2022-2024.

[4]凌曉午，曾強武，安邦權，等.陰道分泌物瑞氏法與懸浮法檢查結果比較[J].重慶醫學，2012，41（31）:3298-3299.

[5] 蘇水蓮，張瑞其，陳桂鳳.陰道毛滴蟲標本染色方法的改進[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2007，25（1）：插2.

[6] 肖婉芬，謝文燕，李志凌，等.瑞氏-姬姆薩與巴氏染色法對精子形態染色效果比較[J].華中醫學雜志，2007,31（6）：436-438.

（2014-01-20收稿 2014-03-12修回）

（本文編輯 閆娟）

Study of the Effects of Improved Wright-Giemsa Staining

SHEN Xingya,ZHANG Haowei,ZHAO Guangming,WEI Hexi,YANG Lishun
Beichen District Chinese Medicine Hospital,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300400,China

ObjectiveTo study the effects of improved Wright-Giemsa staining.Methods40 semen samples by both traditional and improved Wright-Giemsa staining.The morphological characteristics stained by two methods was observed.ResultsThe defective rates of the middle and tail parts of sperm were 7.02％±2.4％and 11.02％±2.03％respectively in improved staining group;while those were 5.48％±2.8％and 8.05％±2.56％in traditional staining group.There was statistical significance between two staining methods(P＜0.05).There was no significant difference of normal sperm and sperm head between these two staining methods;however,improved staining method showed a much clearer nucleus and acrosome staining than that of traditional methods.Improved Wright-Giemsa staining is better for sperm,vaginal discharge and Trichomonas vaginalis.More importantly,axostyle and flagella were clearly stained with the improved method.ConclusionImproved Wright-Giemsa staining is simple and can be used in clinical diagnosis.

spermatozoa；vaginal smears；trichomonas vaginalis；staining and labeling；improved wright-giemsa staining

R329-33

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.023

天津市北辰區計劃外項目自選課題（20121007）

天津中醫藥大學附屬北辰中醫院（郵編300400）