γH2AX對肺癌放射敏感性的預測效果

韓寶林 王 軒李立芳王永志王廣舜

γH2AX對肺癌放射敏感性的預測效果

韓寶林1王 軒2李立芳1王永志1王廣舜3△

目的 探討人肺癌細胞受照后γH2AX表達量變化與肺癌細胞放射敏感性之間的關系。方法選擇肺腺癌A549和小細胞肺癌SBC-3細胞株，采用細胞克隆形成實驗檢測經不同劑量（0、2、4、6、8、10 Gy）照射后A549 和SBC-3細胞的克隆形成率，并繪制細胞生存曲線；應用Western blot檢測經2 Gy放射劑量照射后不同時間點（0 min、30 min、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h）的細胞中γH2AX蛋白表達量。分析γH2AX蛋白表達量變化與腫瘤細胞放射敏感性的相關性。結果小細胞肺癌SBC-3細胞的放射敏感性明顯高于肺腺癌A549細胞。兩種細胞受照后1 h和6 h，γH2AX的表達量均與腫瘤細胞的平均致死劑量（D0）相關。結論γH2AX可以作為肺癌細胞放射敏感性的一個預測指標。

輻射耐受性；γH2AX蛋白；肺癌；放射敏感性

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率居高不下，已成為我國城鎮居民惡性腫瘤的第一位死因[1]。放射治療是不能接受手術治療肺癌患者的主要治療手段，但療效較差，5年生存率僅5％～15％[2]。因為腫瘤的異質性致使肺癌患者的腫瘤放射敏感性差異較大，而臨床上制定放療方案卻能考慮到這種個體化的差異，實現腫瘤個體化治療的關鍵是對腫瘤放射敏感性進行預測。研究發現磷酸化的H2AX（γH2AX）可作為檢測DNA雙鏈斷裂的一個強有力的新標志物[3]。本研究通過檢測人肺癌細胞系A549和SBC-3接受放療后的γH2AX表達水平，研究γH2AX表達與肺癌放射敏感性的關系，探討其作為預測肺癌放射敏感性指標的可行性，以便指導肺癌臨床個體化放療。

1 材料與方法

1.1 材料 肺腺癌A549和小細胞肺癌SBC-3細胞株、PRMI-1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、Dhanks、25 cm2培養瓶、75 cm2培養瓶、PBS、哺乳動物蛋白提取劑、蛋白酶抑制劑、細胞刮刀、離心機、5×上樣緩沖液、AP、TEMED、去離子水、1.5 mol/L Tris-HCl pH8.8、1 mol/L Tris-HCl pH6.8、10％ SDS、30％丙烯酰胺、預染蛋白marker、PVDF膜、一抗、二抗、ECL發光液、化學發光凝膠成像儀、吉姆薩染液。

1.2 細胞克隆形成實驗 將肺腺癌A549和小細胞肺癌SBC-3細胞分別培養于25 cm2培養瓶中，取指數生長期A549和SBC-3細胞，消化、懸浮、計數后，分別接種于10 cm培養皿中，每種細胞株按照不同照射劑量分為0、2、4、6、8、10 Gy，每個劑量設3個平行處理孔，接種后培養24 h待細胞貼壁后，分別給予相應劑量照射（Varian直線加速器，劑量率300 cGy/min）。照射時細胞置于培養瓶或者培養皿中，給予單次X射線照射，培養2周后，棄去培養液，PBS沖洗3遍并吸盡，多聚甲醛固定20 min，吉姆薩過夜染色后清水沖洗，熒光顯微鏡下觀察克隆集落形態，拍照，計數50個以上細胞的的克隆數。根據公式：克隆形成率（PE）=（對照組克隆數/細胞接種數）×100％。計算存活分數（SF）=克隆數/（細胞數× PE）。采用單擊多靶數學模型[S=1-（1-eD/D0）n]擬合細胞生存曲線。

1.3 Western blot實驗 將肺腺癌A549和小細胞肺癌SBC-3細胞分別培養于25 cm2培養瓶中，待細胞貼壁并長滿整個培養瓶約75％體積時，給予2 Gy射線照射，照射后放回細胞培養箱，并在照射后不同時間點（0 min、30 min、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h）將相對應的培養瓶從細胞培養箱中取出，棄去培養液，PBS洗3遍并吸盡，細胞裂解液與蛋白酶抑制劑的混合液提取細胞總蛋白。BCA方法測定蛋白濃度，然后蛋白變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜、封閉、兔抗人γH2AX作為一抗以及兔抗人β-actin為內參封閉過夜。再加入羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，最后進行化學發光反應。實驗重復3次。采用Image J軟件分析Western blot條帶的灰度值。

1.4 統計學方法 采用SigmaPlot擬合放射生存曲線，采用SPSS15.0分析，多組比較采用F檢驗，2組比較采用t檢驗，線性相關分析γH2AX表達量與腫瘤細胞放射敏感性的相關性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌A549細胞和小細胞肺癌SBC-3細胞的放射敏感性 SBC-3細胞的放射敏感性明顯高于A549細胞（F=1 023.221，P=0.033），見圖1。從擬合的細胞生存曲線得出放射敏感性參數SF和平均致死劑量（D0），SBC-3細胞的SF（0.376 vs 0.495）、D0(1.452 vs 2.490)均低于A549細胞。

Fig.1 The cell survival curves of two cell lines圖1 兩種肺癌細胞的生存曲線

2.2 兩種肺癌細胞接受2 Gy照射后γH2AX的表達變化 SBC-3細胞和A549細胞經2 Gy射線照射后，γH2AX蛋白表達量在照射后1 h有明顯升高，在照射后6 h明顯降低，低于1 h（t分別為131.22和97.23，均P＜0.01），見圖2、3。

Fig.2 The expression of γH2AX in A549 with 2 Gy radiation dose detected by Western blot assay圖2 A549細胞株接受2 Gy照射后γH2AX蛋白隨時間變化情況

Fig.3 The expression of γH2AX in SCB-3 with 2 Gy radiation dose detected by Western blot assay圖3 SBC-3細胞株接受2 Gy照射后γH2AX蛋白隨時間變化情況

2.3 γH2AX的表達量變化與腫瘤放射敏感性的相關性 兩種細胞受照后1 h和6 h，γH2AX的表達量均與腫瘤細胞的放射敏感性參數D0相關，見表1。

Tab.1 The relation between radiosensitivity parameter D0and γH2AX expression in two lung cancer cell lines表1 γH2AX的表達量與肺癌細胞D0的相關性（r）

3 討論

克隆形成實驗可用來研究腫瘤細胞的增殖能力及細胞對不同殺傷因素的敏感性[4]。在評價照射導致細胞死亡方面，克隆形成實驗常被作為“金標準”[5]。本實驗的克隆形成實驗結果表明，肺癌細胞系（A549和SBC-3）接受X線照射后，其細胞存活率均下降，且隨著放射劑量增加，細胞存活率逐漸下降；放射敏感性指標顯示，SBC-3細胞對放射線較敏感，表現為該組細胞生存曲線較陡，SF呈最低值0.376，代表平均致死量的D0值較低為1.452 Gy；相反，A549細胞對放射線不敏感，表現為該組細胞生存曲線較平緩，SF呈較高值0.495，代表平均致死量的D0值較低為2.490 Gy。

H2AX是組蛋白H2A家族成員之一。在H2AX的C端有一段由22個殘基組成的高度保守的同源序列，其中包括1個139位的絲氨酸殘基的絲氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸（Ser-Gln-Glu,SQE）結構域[6]。細胞在受到照射后，H2AX的SQE結構域中的絲氨酸殘基迅速磷酸化并在DSBs位點簇集形成焦點。低劑量照射時，磷酸化H2AX所形成的焦點數量與照射造成的DNA雙鏈斷裂數量存在線性相關關系[7]，因此，γH2AX功能之一就是可以作為電離輻射后細胞發生DNA雙鏈斷裂損傷的指示器。DNA損傷時γH2AX能夠快速募集一系列DNA損傷修復相關蛋白和信號因子，如BRCA1、Nbs1、53BP1、MRN復合物，從而間接修復DNA損傷[8]。Celeste等[8]研究發現在H2AX缺陷的細胞發生DNA雙鏈斷裂損傷時，其損傷修復相關蛋白也能向損傷位點處聚集，但是移動速度減慢并且不能持續聚集在損傷位點。一旦γH2AX介導的DNA損傷修復完成后，γH2AX會被蛋白磷酸化酶3等脫磷酸化[9]，形成H2AX，在其他DNA損傷修復中被重新利用，從而使γH2AX在損傷位點被有效地去除。即在電離輻射后，γH2AX存在一個形成與消失的過程，并且此過程體現著DNA損傷及其修復過程。本實驗Western blot實驗結果表明，各實驗組γH2AX水平在照射后一段時間隨著時間增加而增加，在1～2 h達到峰值，在隨后的時間內，各組γH2AX水平隨著時間的推移逐漸降低。γH2AX在受照后1 h、6 h的表達率與兩種肺癌細胞的放射敏感性存在明顯的相關性，且6 h的相關性更好。說明在接受照射后，A549細胞株的DNA損傷發生率明顯低于SBC-3細胞株。而在受照后6 h，受損的DNA的修復率卻明顯高于SBC-3細胞株，這致使A549細胞株在受照后因照射所致的細胞死亡明顯少于SBC-3細胞株，因此，SBC-3細胞株的放射敏感性明顯高于A549細胞株。這些結果與生存曲線反應的結果相一致。所以，細胞在受照后不同時間點的γH2AX表達量的變化可以替代生存曲線來反映細胞的放射敏感性。近年來，已經有研究報道γH2AX可以作為腫瘤細胞DNA損傷的一個靈敏和特異的生物指標，可用于判斷腫瘤對于放療是敏感還是抵抗[9]。

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（2014-01-20收稿 2014-04-10修回）

（本文編輯 閆娟）

Assessing Radiosensitivity of Lung Cancer with the Expression of γH2AX

HAN Baolin1,WANG Xuan2,LI Lifang1,WANG Yongzhi1,WANG Guangshun3△
1 Department of Radiation Oncology,Clinical Hospital of Baodi of Tianjin Medical University,Tianjin 301800,China；2 Department of Intensive Care Unit,3 Department of Oncology△

E-mail:wgs@bdhospital.com

ObjectiveTo observe the relationship between expression changes of γH2AX and the radiosensitivity of lung cancer cells in vitro.MethodsThe radiosensitivity of lung cancer cell lines A549 and SBC-3 was measured by clone forming assay.The DSBs damage of lung cancer cell lines A549 and SBC-3 was determined by Western blot assay.ResultsThe clone forming rates of lung cancer cell lines A549 and SBC-3 were gradually decreased with the increased radiation dose.γH2AX expression was related to the cell radiosensitivity 1 hour and 6 hours after radiated.ConclusionThe phosphorylated histone γH2AX is a powerful tool to monitor DNA DSBs and to predict the radiosensitivity in lung cancer radiotherapy.

radiation tolerance；γH2AX protein；lung cancer；radiosensitivity

R734.2；R815.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.005

天津市衛生局科技基金資助項目（2012KZ003）

1天津醫科大學寶坻臨床學院放療科（郵編301800），2 ICU，3腫瘤科

△通訊作者 E-mail:wgs@bdhospital.com