多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分布及外排泵基因的檢測

孫靜娜劉青松武 艷王國欣劉澤世張 征△

多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分布及外排泵基因的檢測

孫靜娜1劉青松2武 艷1王國欣1劉澤世1張 征1△

目的 了解多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分布并檢測其外排泵基因型。方法統(tǒng)計(jì)96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分布，用Kirby-Bauer法檢測96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)15種抗菌藥物的耐藥情況，并用PCR擴(kuò)增進(jìn)行外排泵基因的檢測。結(jié)果96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌主要分布在重癥監(jiān)護(hù)病房（54.2％）和呼吸內(nèi)科（18.8％）；對(duì)喹諾酮類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥率均在70％以上；分布在重癥監(jiān)護(hù)病房的52株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中檢測到adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM基因分別有18株（34.62％）、16株（30.77％）、18株（34.62％）、18株（34.62％）、0株、18株（34.62％）；分布在呼吸內(nèi)科的18株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中檢測到adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM基因分別有9株、8株、8株、8株、0株、8株。結(jié)論外排泵基因是分布在重癥監(jiān)護(hù)病房和呼吸內(nèi)科的鮑曼不動(dòng)桿菌發(fā)生多重耐藥的重要因素。

鮑氏不動(dòng)桿菌；微生物敏感性試驗(yàn)；多重耐藥；外排泵基因

鮑曼不動(dòng)桿菌在住院患者中多可發(fā)生定植，很容易通過交叉感染在醫(yī)院內(nèi)流行，并且多重耐藥(multidrug resistant,MDR)鮑曼不動(dòng)桿菌日趨增多，尤其在重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）、燒傷病房，耐藥菌株的出現(xiàn)給臨床抗感染治療帶來很大困難。其中，多藥外排系統(tǒng)是鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生多藥耐藥的一個(gè)重要原因，參與了鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢菌素類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素、紅霉素和四環(huán)素的耐藥。本研究對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行臨床分布統(tǒng)計(jì)及外排泵基因型檢測，以更好地了解我院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的臨床分布及外排泵的基因型，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 為2012—2013年我院不同科室送檢的標(biāo)本，包括痰液、尿液及血液等，同一患者多次分離到的同一菌株不重復(fù)計(jì)，共分離出96株對(duì)三類及以上抗生素同時(shí)耐藥的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌。取純培養(yǎng)細(xì)菌增菌液l mL與0.5 mL的50％甘油肉湯混勻，-70℃冰箱保存并備用。標(biāo)準(zhǔn)菌株鮑曼不動(dòng)桿菌（ATCC19606）購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 試劑與儀器 DNA提取Maxwell?16 Cell LEV DNAPurification Kit試劑盒和PCR擴(kuò)增GoTaq?Green Master Mix、GoTaq?Colorless Master Mix購自美國Promega公司；DNA染色劑Goldview和DNA Ladder Marker購自北京賽百盛公司；瓊脂糖X-gal購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；藥敏紙片阿米卡星(AMK)、慶大霉素(GEN)、氨芐西林/舒巴坦(SAM)、哌拉西林(PIP)、頭孢他啶(CAZ)、亞胺培南(IPM)、環(huán)丙沙星(CIP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、美羅培南(MRP)、左氧氟沙星(LEV)、頭孢噻肟(CTX)、復(fù)方新諾明(SXT)、頭孢吡肟(CPR)、頭孢曲松(CRO)、四環(huán)素(TC)購于英國OXID公司。MaxweII-16核酸提取儀（美國Promega公司），AB 9700PCR擴(kuò)增儀（美國AB公司），DYY-12電泳儀（北京六一儀器廠），Vil-Ber LouRMAT凝膠成像系統(tǒng)（法國VILBER LOURMAT公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 按照2012年M02-A11臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）推薦的Kirby-Bauer法進(jìn)行抗菌藥物藥敏試驗(yàn)。

1.2.2 外排泵基因檢測 （1）引物設(shè)計(jì)。根據(jù)GenBank中已發(fā)布的各型基因序列和參考文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM基因PCR引物，見表1，委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。（2）DNA提取。具體操作按Maxwell?16 Cell LEV DNA Purification Kit試劑盒說明書。（3）PCR擴(kuò)增。DNA模板4 μL，上下游引物各1 μL，2×GoTaq?Green Master Mix 12.5 μL，RNase-free水6.5 μL配置PCR反應(yīng)體系(25 μL)；以94℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性1 min，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。電泳緩沖液0.5×TBE，電壓100 V，上樣標(biāo)本量8 μL，DNAMarker（100 bp）8 μL，電泳50 min；置于全自動(dòng)凝膠圖像成像儀上觀察結(jié)果并照相，出現(xiàn)與目的基因片段分子相當(dāng)?shù)臈l帶判為陽性。

Tab.1 PCR primers of adeB，adeR，adeS，adeJ，adeE and abeM genes表1 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM基因PCR引物

2 結(jié)果

2.1 菌株臨床分布及耐藥情況 ICU52株（54.2％），呼吸內(nèi)科18株（18.8％），燒傷科9株（9.4％），腫瘤科6株（6.3％），普外科4株（4.2％），腎內(nèi)科2株（2.1％），心內(nèi)科2株（2.1％），兒科2株（2.1％），精神衛(wèi)生科1株（1.0％）。96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)15種抗菌藥物的耐藥情況，見表2。

Tab.2 The result of drug sensitivity test of 96 acinetobacter baumanii gene表2 96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏結(jié)果

2.2 外排泵基因檢測結(jié)果 96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌檢測到adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM基因分別有33株（34.38％）、32株（33.33％）、33株（34.38％）、33株（34.38％）、0株、33株（34.38％）；分離出的adeB陽性株中，均攜帶有adeS基因，有32株（96.97％）攜帶有adeR。adeB、adeR、adeM、adeS、adeJ基因擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1～5。在ICU的52株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌檢測到adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM基因分別有18株（34.62％）、16株（30.77％）、18株（34.62％）、18株（34.62％）、0株、18株（34.62％）。分布在呼吸內(nèi)科的18株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌檢測到adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM基因分別有9株、8株、8株、8株、0株、8株。

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product of adeB gene圖1 adeB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product of adeR gene圖2 adeR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR product of adeM gene圖3 adeM基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR product of adeS gene圖4 adeS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Fig.5 Agarose gel electrophoresis of PCR product of adeJ gene圖5 adeJ基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌通過其酶機(jī)制、外排泵、抗?jié)B性等極容易形成耐藥菌株[2]。主動(dòng)外排泵由菌體細(xì)胞膜表面蛋白組成，可將進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的藥物排出到細(xì)胞外，外排泵的過度表達(dá)可引起喹諾酮類、慶大霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素敏感性降低[3-4]，近年來，聯(lián)合用藥成為治療多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染的新選擇[5]。本實(shí)驗(yàn)選取了常用的3種三代頭孢菌素和1種四代頭孢菌素，以及含β內(nèi)酰胺酶抑制劑的哌拉西林/他唑巴坦耐藥率均在70％以上；碳氰酶烯類藥物亞胺培南和美羅培南耐藥率分別為34.4％、36.5％，耐藥性相對(duì)較低；氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類抗菌藥物的耐藥率為78.1％～94.8％，提示臨床醫(yī)生在針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染時(shí)，一定要根據(jù)藥敏結(jié)果合理選擇抗菌藥物。

本研究的96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中，ICU為標(biāo)本來源最多的科室，達(dá)54.2％，其次呼吸內(nèi)科18.8％，表明外排泵基因是分布在ICU和呼吸內(nèi)科的鮑曼不動(dòng)桿菌發(fā)生多重耐藥的重要因素，ICU和呼吸內(nèi)科是鮑曼不動(dòng)桿菌感染的高發(fā)病區(qū)，患者自身基礎(chǔ)性疾病較重，免疫力低下，大量使用抗菌藥物，且機(jī)械通氣及介入導(dǎo)管的醫(yī)療行為較多，給該菌的感染提供了有利環(huán)境及途徑[6]。本院呼吸內(nèi)科分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中adeB、adeR、adeS、adeJ、adeM攜帶率比ICU高，這可能與ICU檢出的菌株數(shù)較多，ICU醫(yī)護(hù)人員防治多重耐藥菌感染意識(shí)較強(qiáng)，工作更加規(guī)范有關(guān)。

Yoon等[7]認(rèn)為adeR是一個(gè)典型的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，adeS激活細(xì)菌組氨酸激酶，二者一起針對(duì)外界刺激調(diào)節(jié)目的基因adeB表達(dá)，本研究在adeB基因陽性菌株中，有100％菌株攜帶adeS基因，96.97％菌株攜帶有adeR基因，提示adeR和adeS可能與adeB表達(dá)相關(guān)，與Yoon等[7]研究結(jié)論基本一致。

[1]Hou PF,Chen XY,Yan GF,et al.Study of the correlation of imipenem resistance with effluxpumps AdeABC,AdeIJK,AdeDE and AbeM in clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J].Chemother,2012,58(2):152-158.

[2]Song CH,Lu SY,Zhang XY,et al.Analysis of multi-drug resistance and homology of Acinetobacter baumannii[J].Chinese Journal of Microecology，2013，25(2):161-164.[宋彩虹，陸水英，張秀瑜，等.鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株的耐藥性及同源性分析[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25(2):161-164.]

[3]She TT,Shen JL，Xu YH,et al.A study on mechanism of carbapenem resistance on pan-drugresistant Acinetobacter baumannii[J].Acta Universitatis Medicinalis Anhui,2012,47(3):274-278.[佘婷婷，沈繼錄，徐元宏，等.泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐碳青霉烯類抗生素機(jī)制研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,47(3):274-278.]

[4]Rajamohan G，Srinivasan VB，Gebreyes WA.Molecular and functional characterization of a novel efflux pump,AmvA,mediating antimicrobial and disinfectant resistance in Acinetobacter baumannii [J].J Antimicrob Chemother,2010,65(9):1919-1925.

[5]Qiao SX,Yu YX.Drug resistance and clinical uses analysis of pandrug resistant Acinetobacter baumannii in the respiratory department[J].Tianjin Med J,2013,41(11):1126-1127.[喬淑新，于云翔.呼吸內(nèi)科病房泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性及臨床用藥分析[J].天津醫(yī)藥，2013，41（11）:1126-1127.]

[6]Du HL,Zhen P,Yao XJ,et al.Clinical distribution and changes in drug resistance of Acinetobacter Baumanii between 2005 and 2011 [J].Modern Preventive Medicine,2013,40(20):3848-3850.[杜紅麗,甄萍,姚新潔,等.2005～2011年鮑曼不動(dòng)桿菌的臨床分布與耐藥性變遷[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2013,40(20):3848-3850.]

[7]Yoon EJ,Courvalin P,Grillot-Courvalin C.RND-type efflux pumps in multidrug-resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii: major role for AdeABC overexpression and AdeRS mutations[J].Antimicrob Agents Chemother,2013,57(7):2989-2995.

（2014-07-01收稿 2014-08-01修回）

（本文編輯 李國琪）

Clinical Distribution and the Detection of Multiple Drug-Resistant Acinetobacter Baumannii Efflux Pump Genotypes

SUN Jingna1,LIU Qingsong2,WU Yan1,WANG Guoxin1,LIU Zeshi1,ZHANG Zheng1△
1 Clinical Laboratory，the First Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050031,China;2 Department of General Surgery,Baoding Rongcheng Hospital
△

E-mail:zhangzheng197101@163.com

ObjectiveTo study the clinical distribution and detection of the efflux pump gene in multiple drug-resistant acinetobacter baumannii.MethodsThe clinical distribution of 96 strains of multiple drug-resistant acinetobacter baumannii was analyzed.K-B method was used to detect 96 strains of multi resistant bauman resisted to 15 kinds of antibiotics.PCR amplification was used to detect the efflux pump gene.ResultsNinety-six strains of multiple drug-resistant acinetobacter baumannii mainly distributed in intensive care unit(ICU,54.2％)and respiratory department(18.8％).The drug resistance rates to quinolone,cephalosporins,amino glucoside,tetracycline were above 70％.The 52 strains of multiple drug-resistant acinetobacter baumannii detected in ICU included 18 strains of adeB(34.62％),16 strains of adeR(30.77％), 18 strains of adeS(34.62％),18 strains of adeJ(34.62％),0 strain of adeE and18 strains of adeM(34.62％).The18 strains of multiple drug-resistant acinetobacter baumannii detected in respiratory department included 9 strains of adeB,8 strains of adeR,8 strains of adeS,8 strains of adeJ,0 strain of adeE and 8 strains of adeM.ConclusionEfflux pump genes are important factors for multiple drug-resistant acinetobacter baumannii distributed in ICU and respiratory department.

acinetobacter baumannii;microbial sensitivity tests;multiple drug resistant;efflux pump gene

R378.99

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.014

河北省科技廳科技支撐計(jì)劃（112061178D）

1河北省石家莊市河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科（郵編050031）；2河北省河北保定市容城縣醫(yī)院普外科

△通訊作者 E-mail：zhangzheng197101@163.com